EAE時第四腦室外側隱窩的形態(tài)學研究.pdf

1、目的：對EAE不同時期的大鼠第四腦室外側隱窩形態(tài)學進行動態(tài)觀察，探討該部位室管膜及室管膜下結構的變化特點以及與功能的關系。
　　 材料與方法：選擇健康Wistar雌性大鼠64只，體重200g±20g，主動免疫，制備EAE模型。在免疫后，7天為潛伏期組，14天為臨床極期組和21天為恢復期組，健康Wistar雌性大鼠作為對照組。常規(guī)經(jīng)心灌注固定取腦的第四腦室外側隱窩，分別對該部位室管膜及室管膜下進行光鏡結構觀察（HE）；細胞凋亡的形

2、態(tài)學觀察；掃描電鏡以及透射電鏡觀察。
　　 1、EAE模型制備：動物腹腔內注射6％水合氯醛（0.5ml/100g體重）麻醉后，碘酒、酒精局部消毒，用豚鼠脊髓勻漿加完全福氏佐劑（GPSCH-CFA）制成的乳劑，每只腳墊皮內注射GPSCH-CFA乳劑0.1ml，共計0.4ml。
　　 2、光鏡標本制備：動物腹腔內注射6％水合氯醛（0.5ml/100g體重）麻醉，打開胸腔，經(jīng)心升主動脈快速灌注37℃生理鹽水，同時剪開右心耳，生

3、理鹽水灌注量100ml。從右心耳流出的液體變淡后，迅速換成4％多聚甲醛磷酸緩沖液（0.1M，pH7.2）進行快速灌注，動物出現(xiàn)抽搐僵直的現(xiàn)象為最佳效果，快速灌注200ml后再慢速灌注此液200ml，整個過程需40分鐘。灌注完畢取出整腦，去除腦橋以上部分和延髓以下的部分，取中間腦組織塊在上述固定劑中（4℃）后固定24小時，然后在磷酸緩沖液（0.1M，pH7.2）中沖洗三次，每次6小時，再用梯度酒精脫水，入二甲苯中透明，浸蠟，包埋，修塊，石

4、蠟連續(xù)切片，載片撈片，60℃烤箱過夜。然后依次入二甲苯脫蠟，梯度酒精置換，蘇木精染色及伊紅復染。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。室溫風干后，顯微鏡觀片，OLYMPUS萬能顯微鏡照相。
　　 3、TUNEL樣品制備：動物的麻醉、灌注、取材和后固定、石蠟切片過程同光鏡標本制備，切片厚5μm，標記過程如下：梯度酒精置換入水后，蛋白酶K消化（20μg/ml）30分鐘，0.3％H2O2甲醇液室溫孵育30分鐘，冰上孵育2分鐘后，加上

5、TUNEL反應液50ul，在濕盒中37℃下孵育1小時，加入50ul轉化劑-POD，在濕盒中37℃下孵育30分鐘，加入底物DAB溶液，室溫下孵育10分鐘。標記過程中，每步間用PBS沖洗。脫水、透明，蘇木素復染，封片。室溫風干后，顯微鏡觀片，OLYMPUS萬能顯微鏡照相。
　　 4、掃描電鏡樣品制備：麻醉、灌注方法同光鏡標本制備，但灌注液為4％的多聚甲醛和2.5％戊二醛磷酸緩沖液（0.1M，pH7.2）（多聚甲醛磷酸緩沖液灌注前一天

6、配出，4℃保存；戊二醛在灌注之前再加入多聚甲醛溶液）。灌注完畢取整腦，然后經(jīng)正中線切開整腦，將腦分為左右兩塊在上述固定劑中（4℃）后固定12小時。取一側腦塊從背側移去小腦，暴露第四腦室底和外側隱窩，沿著中腦上端，延髓下端冠狀方向將多余的腦組織去除，之后將腦組織塊放入磷酸緩沖液（0.1M，pH7.2）中過夜后，再用上述磷酸緩沖液沖洗切塊三遍，然后梯度酒精脫水，叔丁醇置換，二氧化碳臨界點干燥，真空噴金，日立S-3500N觀察、照像。

7、　　 5、透射電鏡樣品制備：取材過程同掃描電鏡樣品制備，在灌注固定后，經(jīng)正中線切開整腦，從背側去除小腦，暴露出第四腦室底，切取外側隱窩入口處腦塊3×3×2mm，然后投入1％鋨酸固定液作后固定，磷酸緩沖液沖洗三次，梯度酒精脫水，Epon812包埋，LKB-V型超薄切片機切片，H-600型透射電鏡觀察照相。
　　 結果：
　　 1、光鏡觀察結果：正常對照組室管膜細胞排列稀疏；EAE大鼠潛伏期（7天）組室管膜細胞排列密集，室

8、管膜下組織疏松，血管豐富、擴張；發(fā)病極期（14天）組室管膜細胞排列更加密集，室管膜下組織極度水腫，室管膜層與其下層有部分分離，血管周圍及室管膜下有大量的炎性細胞浸潤；恢復期（21天）組室管膜細胞排列密集，室管膜下組織疏松，血管擴張。
　　 2、TUNEL組化細胞凋亡的觀察結果：光鏡下凋亡細胞的形態(tài)呈棕黃色或棕褐色著色，典型的凋亡細胞形態(tài)學改變?yōu)榧毎冃∽儓A，核固縮。正常對照組偶見凋亡細胞，實驗組EAE潛伏期室管膜細胞出現(xiàn)凋亡細胞

9、、發(fā)病極期室管膜及室管膜下血管周圍凋亡細胞密集，恢復期凋亡細胞數(shù)量遞減。凋亡細胞排列的密集程度，經(jīng)統(tǒng)計學處理，EAE實驗組與正常對照組比較差異均有顯著性（P<0.01）；14天組與7天組和21天組比較有顯著性差異；7天組與21天組無差異。
　　 3、掃描電鏡觀察結果：本研究在電鏡下觀察到EAE大鼠第四腦室外側隱窩室管膜細胞有分泌現(xiàn)象，分泌顆粒呈囊泡球形，表面光滑，多成堆集中分布，出口處發(fā)現(xiàn)有大量的巨噬樣細胞和淋巴樣細胞。

10、　　 結論：
　　 1、第四腦室外側隱窩室管膜及室管膜下，凋亡細胞在EAE組較正常對照組明顯增多，發(fā)病極期凋亡細胞達最多，凋亡細胞隨EAE時程呈單峰變化趨勢，且較相臨部位明顯增多。
　　 2、光鏡觀察，第四腦室外側隱窩室管膜及室管膜下在不同的時程有顯著的變化，室管膜細胞可增多，室管膜下組織水腫，血管擴張，炎性細胞浸潤。各期變化程度依次是發(fā)病極期>恢復期>潛伏期。
　　 3、在EAE大鼠應用掃描電鏡和透射電鏡觀察