胎膜早破危險因素及BV菌群檢測方法的研究.pdf

1、研究背景 胎膜早破(premature rupture of fetal membranes，PROM)是指在臨產前胎膜破裂，國內發(fā)生率占分娩總數的2.7％～17％，國外為5％～15％，而且近年來其發(fā)病率呈逐年升高趨勢。胎膜早破一方面容易導致孕產婦宮內感染、產褥感染、難產，增加羊水栓塞的機率，另一方面誘發(fā)宮內窘迫、臍帶脫垂、胎嬰兒感染和早產等。研究報道，約30％～40％的胎膜早破可并發(fā)早產，臨床上有近1/3的早產被證實由此引起，

2、從而增加了圍生期母嬰各種并發(fā)疾病的發(fā)病率和死亡率。 生殖道感染、吸煙、微量元素與維生素缺乏等是胎膜早破的危險因素，其中生殖道病原微生物上行性感染是引起胎膜早破的主要原因。常見的病原體有β-溶血性鏈球菌、淋球菌、沙眼衣原體及某些厭氧菌等。病原體經宮頸口感染胎膜，也可經血行播散至子宮、胎盤，發(fā)生羊膜炎、絨毛膜羊膜炎。生殖道感染中亟待解決的問題是細菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)菌群分類與胎膜早破的關系。隨著

3、經濟的發(fā)展和城市化進程的加快，人們的生活水平有了提高，但同時也帶來了微環(huán)境的污染。研究發(fā)現室內裝修與自然流產和胎兒畸形等有關聯，但與胎膜早破是否有關尚未見報道。 研究目的 采用傳統(tǒng)流行病學和分子流行病學方法，探討與胎膜早破發(fā)生有關聯的危險因素。通過病例對照研究、分子流行病學和基因．環(huán)境交互作用分析，從易感基因和環(huán)境因素兩方面分析胎膜早破的危險因素，并建立不依賴培養(yǎng)16S rRNAPCR-DGGE檢測BV菌群分類方法，為胎

4、膜早破防治提供科學依據。 研究方法 1.胎膜早破危險因素研究采用前瞻性隊列觀察方法，從妊娠開始建立觀察隊列，跟蹤隨訪至分娩。對2006年4月至2007年11月在濟南市婦幼保健院孕期保健并分娩的婦女，進行問卷調查和隨訪檢查記錄，收集孕婦及胎兒的監(jiān)測資料。調查內容包括孕婦的一般特征，婦科和孕期檢查記錄，分娩情況，生殖道感染情況，孕婦、丈夫煙酒和接觸毒物情況(妊娠期住在新裝修房間的時間)及流產史等。描述監(jiān)測孕產婦的流行病學特征

5、。以發(fā)生胎膜早破者作為指示病例組，以未發(fā)生并發(fā)癥者(包括胎膜早破)作為指示對照組，應用非條件Logistic回歸分析胎膜早破發(fā)生的危險因素。 2.易感基因與胎膜早破關聯研究采集研究對象的靜脈血提取DNA，采用PCR-RFLP法檢測維生素D受體(Vitamin D receptor,VDR)和白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)基因多態(tài)性； 采用焦磷酸測序法檢測亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylene

6、tetrahydrofolatereductase，MTHFR)和基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase，MMPs)的基因多態(tài)性。以基因野生型純合子為比較的基線(OR=1.0)，采用Logistic回歸分析突變基因與胎膜早破的關聯強度(OR)。將基因與其他危險因素(生殖道感染、BV、被動吸煙、室內裝修)相結合，分析環(huán)境．基因間的交互作用。 3.細菌性陰道病菌群檢測方法的研究采集陰道分泌物提取微生物的

7、：DNA；使用針對細菌保守區(qū)設計的通用引物(正向引物帶“GC”夾)，對提取的DNA進行PCR擴增，DGGE電泳對細菌進行分類，再次PCR擴增的產物純化測序。測序結果使用Vector NTI9.0等軟件進行對接，同時與Genbank、歐洲核糖體數據庫和自建的16S rRNA數據庫進行比對，按照97.5％同源性標準確定微生物種類。為進一步驗證結果的準確性，建立針對常見菌株的單一PCR和同時檢測多個已知菌株的多重PCR技術。 4.統(tǒng)計

8、學處理以FOXPRO 8.0建立數據庫，使用SPSS 15.0軟件進行數據分析，計數資料采用相對數指標，顯著性檢驗用x2檢驗。采用非條件Logistic回歸分析危險因素，觀察指標為比值比(OR)及其95％可信區(qū)間(95％CI)。 結論 1.室內裝修、生殖道感染、流產史和被動吸煙是胎膜早破的危險因素。 2.單因素分析發(fā)現MTHFR C677T、 MMP-9 C-1562T、VDR TaqI和IL-1β +35

9、93四個基因位點多態(tài)性與胎膜早破無顯著性關聯。 3.基因-環(huán)境交互作用分析發(fā)現：MMP-9、MTHFR和VDR基因與室內裝修有協同作用；MTHFR和IL-1β基因與被動吸煙有協同作用；IL-1β基因與BV感染之間存在協同作用，增加了胎膜早破發(fā)生的危險性。 4.建立了陰道加德納菌、陰道奇異菌和動彎桿菌的多重PCR方法；建立了不依賴細菌培養(yǎng)的16S rRNA-PCR-DGGE對BV菌群檢測的新方法，可以對BV菌群進行分類和動

10、態(tài)變化監(jiān)測。多重PCR方法也可以對PCR-DGGE檢測結果進行驗證。 意義與創(chuàng)新 1.本研究運用傳統(tǒng)流行病學研究方法，國內首次發(fā)現妊娠期居住環(huán)境中有害物質(苯和甲醛)增加發(fā)生胎膜早破的危險性。 2.本研究發(fā)現MTHFR C677T、MMP-9 C-1562T、VDR TaqI和IL-1β+3593四個基因位點多態(tài)性與胎膜早破無顯著性關聯；但基因一環(huán)境交互作用分析發(fā)現與室內裝修有協同作用的基因位點有MTHFR C6

11、77T、VDR TaqI、MMP-9C-1562T；與被動吸煙有協同作用的有MTHFR C677T、IL-1β+3593；與BV感染有協同作用的基因位點是IL-1β+3593，環(huán)境因素增加了這些基因型攜帶者胎膜早破發(fā)生的危險性。 3.建立了16S rRNA PCR-DGGE檢測BV菌群分類方法，并建立了16S rRNA數據庫，為測序結果的比對分析提供了基礎。該方法可用于BV的快速診斷和菌群分類及動態(tài)漂移的監(jiān)測，為BV有效防治措施