病原性絲狀真菌快速診斷和鑒定的實驗研究.pdf

1、第一部分絲狀真菌DNA提取方法的比較和優(yōu)化
　　 目的篩選適合提取絲狀真菌模板DNA的方法。方法比較2個菌落培養(yǎng)時間段（3d內和7～14d）提取DNA質量的差異：運用氯化芐法、CTAB法、Biospin法和微波法分別提取黑曲霉基因組DNA，后用直接電泳、濃度測定、PCR擴增等方法比較所提DNA的濃度和質量；選出最優(yōu)方法，用8種常見絲狀真菌進行檢驗和驗證。
　　 結果：培養(yǎng)3天內的菌落提取的DNA純度較高，無需純化即可用于

2、后續(xù)實驗；4種方法制備的DNA均可用于PCR等后續(xù)實驗，其中以CTAB法提取的DNA純度好，產率最高。結論CTAB法是一種適用于絲狀真菌DNA提取的簡便方法。
　　 第二部分 PCR-RFLP技術快速鑒別8種致病絲狀真菌病原菌的實驗研究
　　 目的建立能應用于臨床檢測深部絲狀真菌感染病原菌的PCR-RFLP方法。方法用真菌通用引物擴增煙曲霉、黃曲霉、土曲霉、黑曲霉、雜色曲霉、構巢曲霉、尖端賽多孢和串珠鐮刀菌的ITS區(qū)，分

3、別用HhaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ，TaqⅠ和MspⅠ5種限制性核酸內切酶對PCR產物進行酶切，建立以PCR為基礎的RFLP方法，然后對22株臨床株和2株環(huán)境分離株進行PCR-RFLP圖譜分析。結果對PCR產物進行RFLP分析可以準確鑒定8種深部致病絲狀真菌，從DNA提取到酶切分析可以在一個工作日中完成；22株臨床株和2株環(huán)境分離株PCR-RFLP鑒定結果與傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定結果一致。結論PCR-RFLP技術是一種能夠快速鑒定深部感染絲狀

4、真菌的有效方法。
　　 第三部分多重PCR檢測深部曲霉感染病原菌的實驗研究
　　 目的建立能同時鑒別多種曲霉病原菌的多重PCR體系。方法篩選4種最常見深部曲霉感染病原菌（煙曲霉、黃曲霉、土曲霉和黑曲霉）的特異性引物建立多重PCR體系，用該體系檢測4種曲霉單模板、雙模板和三模板的擴增情況，用DNA模板連續(xù)稀釋的方式檢測該反應體系的敏感性。然后對22株臨床株和2株環(huán)境分離株進行檢測。結果該多重PCR體系有較好的特異性，4種曲

5、霉分別擴增出250 bp，200bp，450 bp和150 bp的DNA片段，電泳圖中能夠很好區(qū)別；在合適的反應條件下，對單模板、雙模板和三模板均能擴增出目的片段，未見明顯非特異片段的干擾；多重PCR體系的敏感性為100pg，較單種特異性引物的敏感性（10pg）略差。結論多重PCR體系能夠檢測4種曲霉的單純感染和混合感染，是一種快速、敏感、特異性強的診斷方法。
　　 第四部分菌落PCR快速鑒別絲狀真菌的實驗研究
　　 目

6、的探討菌落PCR在檢測絲狀真菌病原菌方面的運用。方法初步建立絲狀真菌菌落PCR的檢測技術，用19種絲狀真菌標準株進行驗證，選取部分菌種的菌落PCR產物和酶切結果與常規(guī)PCR產物和酶切結果進行比較；所有菌落PCR產物進行測序，檢測其準確性。結果19株菌中有16株（占84.2％）菌落PCR擴增成功；其中有7株菌進行了菌落PCR與常規(guī)PCR產物及酶切圖譜的比較，結果條帶完全一致；16株擴增成功的菌株ITS區(qū)測序結果與傳統(tǒng)形態(tài)學結果一致。結論菌

7、落PCR可以用于絲狀真菌的快速檢測，不僅縮短了菌落形態(tài)學鑒定所需的較長時間，而且也節(jié)省了制備模板DNA的時間和成本，是一種快速、經濟的PCR檢測技術。
　　 第五部分菌落PCR快速鑒定菌種的臨床應用
　　 目的探討菌落PCR在臨床標本檢測中的應用。方法收集1例皮下真菌感染的臨床標本，在真菌培養(yǎng)長出菌落伊始即進行菌落PCR檢測，擴增ITS區(qū)進行測序，鑒定病原菌的菌種；收集淺部真菌感染的臨床標本（指趾甲、皮屑）11例，選擇真