粒細胞集落刺激因子對肝硬化大鼠腸細菌轉(zhuǎn)位及小腸Toll樣受體4表達的影響.pdf

1、背景和目的：肝硬化是臨床常見消化道疾病，并發(fā)癥有消化道出血、肝細胞肝癌、肝性腦病、肝腎綜合征和感染等，是目前嚴重影響人類健康的疾病之一。肝硬化患者有自發(fā)性腹膜炎、菌血癥等嚴重感染的易感性。腸道來源的革蘭陰性需氧菌如大腸桿菌是肝硬化時細菌感染的主要致病菌。肝硬化者常有腸道細菌過度生長，進而造成腸道細菌轉(zhuǎn)位，是腸源性細菌感染的重要原因之一。而腸細菌過度生長和腸細菌轉(zhuǎn)位又可以通過內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導途徑誘導一系列的細胞因子產(chǎn)生，進一步加重肝臟的損害

2、。 Toll樣受體是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的免疫受體，它通過識別病原微生物及其細胞壁上脂多糖來啟動先天性免疫，并能通過信號傳導啟動獲得性免疫，在機體的免疫防御中起重要作用。目前哺乳動物中共發(fā)現(xiàn)12個Toll受體，分布于各個器官臟器。通過信號傳導可促進細胞因子的合成和釋放；促進免疫細胞的成熟和分化，并表達相關(guān)的免疫分子，調(diào)節(jié)免疫反應。Toll樣受體尚能識別自身組織和同種異體組織，引起器官臟器的免疫耐受，也能引起自身免疫功能紊亂，在維持機

3、體的正常功能和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展方面有重要作用。Toll樣受體特有的識別功能為臨床某些疾病的防治，如內(nèi)毒素休克、全身炎癥反應綜合征、腫瘤、變應性疾病、宿主同種免疫排斥反應等提供了新的途徑。 目前認為Toll樣受體4(TLR4)為內(nèi)毒素細胞跨膜信號傳導的關(guān)鍵性受體。內(nèi)毒素經(jīng)細菌釋放后，由脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)運輸至細胞膜表面，LPS 以LPS-LBP-CD14復合物形式與TLR4胞外段輔助蛋白 MD-2結(jié)合，引起TLR4胞

4、內(nèi)結(jié)構(gòu)構(gòu)象變化，促使一系列下游銜接蛋白募集至胞內(nèi)端的TIR結(jié)構(gòu)域。這些銜接蛋白包括MyD88、Tollip、TIRAP等。這些銜接蛋白繼而通過一系列下游分子引發(fā)酶學級聯(lián)反應，并激活轉(zhuǎn)錄因子NF-kB、AP-1等轉(zhuǎn)錄目的基因。NF-kB和AP-1的活化均可導致炎癥因子如TNF-α、IL-1等的大量表達，形成炎癥。 粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是臨床常用免疫調(diào)節(jié)劑，在體內(nèi)作用廣泛，如誘導粒系干細胞分化、促使中性粒細胞成熟、激活中

5、性粒細胞并促使其分泌各種炎癥因子等。研究發(fā)現(xiàn)，粒細胞集落刺激因子在體外可促進TLR4mRNA表達，并通過TLR4細胞內(nèi)信號傳導，使得其效應分子TNF-α分泌增加。G-CSF有可能通過促進體內(nèi) TLR4基因的表達，使得炎癥因子表達增加，從而促進內(nèi)毒素血癥清除，并達到免疫調(diào)節(jié)的目的。本研究目的是評價G-CSF對肝硬化大鼠腸細菌過度生長、細菌轉(zhuǎn)位的影響以及G-CSF對肝臟可能存在的保護作用；通過對TLR4在肝硬化大鼠腸道表達的研究，了解肝硬化

6、大鼠腸道TLR4表達與腸道細菌免疫的關(guān)系。 方法：采用用皮下注射四氯化碳橄欖油溶液聯(lián)合戊巴比妥飲水的方法誘導肝硬化大鼠模型。于第9周開始將模型大鼠分為兩組：干預組和模型組，其中干預組大鼠用G-CSF進行干預。第10周留取標本。大鼠血清進行生化檢測。取小腸內(nèi)容物稀釋后接種于麥康凱瓊脂平板在微需氧環(huán)境、36.9℃溫箱里培養(yǎng)24-48h，進行菌落計數(shù)。取肝、脾、腸系膜淋巴結(jié)組織少許制成勻漿后接種于麥康凱瓊脂平板在微需氧環(huán)境、36.9℃

7、溫箱里培養(yǎng)24-48h，進行陽性率計數(shù)，并進行細菌定性分類。肝臟病理HE染色和網(wǎng)染，進行肝臟炎癥分級、纖維化分期檢查。大鼠小腸組織進行TLR4免疫組織化學染色，計算陽性面積百分比。小腸組織總RNA抽提，調(diào)整總RNA濃度后進行逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增，電泳，與β-actin內(nèi)參進行條帶灰度比較。 結(jié)果：實驗大鼠共死亡6只，總死亡率15％。G-CSF干預組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平明顯低于模型組

8、和正常組。G-CSF干預組大鼠肝臟損害較模型組減輕(肝臟病理炎癥分級秩次8.46vs17.82；肝纖維化分期平均秩次7.79vs18.39)。G-CSF干預組腸細菌過度生長發(fā)生率(G-CSF干預組vs模型組：58.3％vs92.9％)和細菌轉(zhuǎn)位的發(fā)生率(G-CSF干預組vs模型組：33.3％vs57.1％)均低于模型組。小腸TLR4免疫組化染色三組均有表達，模型組陽性表達平均秩次高于干預組，干預組高于正常對照組。RT-PCR研究也有同樣

9、的發(fā)現(xiàn)。 結(jié)論： 1．肝硬化大鼠存在腸道細菌過度生長和細菌轉(zhuǎn)位。 2．肝臟損害的程度與腸道細菌過度生長和細菌轉(zhuǎn)位有相關(guān)性。 3．G-CSF可降低肝硬化大鼠腸細菌過度生長和細菌轉(zhuǎn)位的發(fā)生率，G-CSF干預組大鼠肝臟損害較模型組減輕。 4．TLR4在各組大鼠小腸粘膜均有表達。 5．大鼠腸道TLR4的表達增加與腸道細菌過度生長和細菌轉(zhuǎn)位有關(guān)，發(fā)生腸細菌過度生長和細菌轉(zhuǎn)位的大鼠腸道TLR4有較高的