口服狂犬病疫苗的制備和應用研究.pdf

1、狂犬病是一種由狂犬病病毒引起的人畜共患疾病,該病在全球分布很廣,每年死于狂犬病的人數超過5.5萬人,其中約95％發(fā)生在亞洲和非洲。大多數死亡事件均是被狂犬病毒感染的狗咬傷所致,受害者中30％～60％為15歲以下兒童?？袢〉念A防和治療通常采用狂犬病疫苗,對于嚴重感染者還須使用人源或馬源免疫球蛋白進行治療。目前通過美國FDA認證的狂犬病疫苗為神經組織疫苗和Vero細胞培養(yǎng)疫苗,其中Vero細胞培養(yǎng)疫苗應用最為廣泛,但因其制備成本高,注射方

2、式和保存方法要求嚴格等因素,一些落后、貧窮的國家仍采用有嚴重副反應的神經組織疫苗,而Vero細胞培養(yǎng)疫苗也只是用于發(fā)達國家和部分發(fā)展中國家。
　　 新一代狂犬病疫苗主要從以下幾方面進行研究:(1)以腺病毒載體為基礎的重組病毒疫苗。這類疫苗雖能刺激新生小鼠產生強烈的初次免疫應答,但對成年動物免疫效果還不明確,并且病毒載體還有整合至宿主染色體的潛在危險。(2)DNA疫苗。這類疫苗可刺激機體產生中和性抗體、CD4+細胞免疫和CD8+細

3、胞免疫反應,但注射要求高,免疫效率低,有一定的應用局限。(3)減毒疫苗。這類疫苗可快速并大量復制狂犬病病毒糖蛋白,免疫效果好且為單劑量注射,但抗體產生具有遲滯性特點,不能及時進行暴露后治療,而且病毒中致病性成份還需通過分子手段進一步去除,以降低潛在的致病危險。(4)抗體疫苗。這類疫苗采用雞尾酒療法效果良好,有望替代人源或馬源免疫球蛋白。但因狂犬病毒株有地域差異特點,導致病毒株糖蛋白基因型多樣化,通過單一毒株制備的單克隆抗體不具有良好的適

4、應性。
　　 消化道給藥治療是通過口服含有治療性的外源物質,利用消化道吸收功能,使外源物質達到特定部位,糾正出錯基因或表達分泌出治療性蛋白,發(fā)揮治療性作用,從而達到治療或預防疾病的目的。重組微生物體是目前研究較多的口服藥物運送載體之一,它通過消化道給藥可以以低劑量的方式達到與普通胃腸道藥物載體給藥相似的治療效果。重組微生物在消化道內釋放生物活性物質主要通過三種方式,一通過細胞自溶釋放胞內物質；二活性物質錨定于細胞壁:三活性物質自

5、細胞分泌到消化腔內。為進行這一研究,本課題選擇的微生物載體為釀酒酵母。重組酵母進入消化道后如果存活,就可能會繼續(xù)進行分泌或通過自溶為機體提供G蛋白。外源蛋白在消化道環(huán)境中易形成乳糜微粒,這些微粒可通過淋巴管進入消化道具有豐富的粘膜毛細血管中,進而進入血液循環(huán)系統,被輸送至包括血液在內的各個臟器,引起免疫反應,最終刺激機體產生中和性抗體。
　　 為探索這一研究的可行性,我們首先通過生物信息學手段對實驗用狂犬病病毒糖蛋白基因CVS2

6、4-G進行分析,確定了該蛋白的常規(guī)理化性質和基本結構:(1)CVS24糖蛋白分子大小約58.4kD,等電點為7.27。(2)該蛋白全長524aa,其中1～19aa為信號肽(Ss),28～458aa為膜外區(qū)域,459～478aa為跨膜區(qū)(TD),479～524aa為膜內區(qū)。(3)該蛋白去除信號肽后產生505aa的成熟蛋白,成熟蛋白上有四個糖基化位點,分別位于37aa,247aa,319 aa和480 aa。(4)通過CVS24-G與常用疫

7、苗株3aG/PV/CTN的基因比對,發(fā)現CVS24-G基因與3aG/PV的G基因同源性達90％以上,與CTN株同源性達87％以上,糖基化位點與三種疫苗株基本一致。(5)結合蛋白質的柔性區(qū)間,抗原指數,表面可及指數和親水性分析,預測CVS24-G蛋白可能的抗原表位區(qū)間為67～74,264～269,275～283,295～307,321～324,326～339,376～380,407～415。與目前已知的抗原位點相比,該蛋白的關鍵抗原表位位

8、點330 aa,333 aa和339 aa位點在預測范圍內。CVS24-G與其它三種疫苗株相比,除Ser(34)位為Arg(34)替代外,其余表位均表現一致。其中在決定毒株致病力的K330和R333位點上,CVS24-G與其它三種疫苗株一樣,K(1ys)和R(Arg)分別由F(Phe)和A(Ala)替代,這兩個位點的改變大大降低了它們的致病力,成為減毒株。由此可判斷實驗用狂犬病病毒糖蛋白基因可用于本課題的疫苗研究。因此,采用生物信息學手

9、段分析預測基因結構功能和抗原表位位點,為疫苗的制備奠定基礎。
　　 實驗第二階段,構建了pYes-G(-SS)和pYes-InG(-SS-TD)兩種重組載體。兩種載體分別采用醋酸鋰法轉化酵母,Ura營養(yǎng)缺陷篩選陽性重組子,SDS-PAGE和Western blot分離鑒定目的蛋白等方法,研究了糖蛋白基因在釀酒酵母中的胞內表達和分泌表達。pYes-G(-SS)胞內表達研究結果顯示,(1)去除信號肽的CVS24-G基因在釀酒酵母中表

10、達的重組蛋白可能以兩種形式存在,分別為yGI66kD和yG Ⅱ 58kD,而Western blot結果顯示僅yG Ⅱ 58kD可與單克隆抗體結合,發(fā)生顯色反應。結合其他研究結果,可以初步認為,在釀酒酵母中,CVS24-G蛋白TD區(qū)可能會影響yGI蛋白中抗原位點的暴露,從而影響它與單克隆抗體的結合。為驗證這一判斷,我們構建了去除TD區(qū),但同時連接菊粉酶信號肽的融合基因InG,即pYes-InG(-SS-TD)重組載體,并研究了該融合基因

11、在釀酒酵母中的分泌表達情況。首先,為增強結果的可比性,分別提取了pYes-G和pYes-InG重組酵母的胞內蛋白,SDS-PAGE分析比較發(fā)現,去除TD的CVS24-G基因在釀酒酵母中表達的重組蛋白大小與G(-SS)重組蛋白yG Ⅱ一致,從條帶濃度判斷,表達量略高于pYes-G重組酵母表達時yGⅡ的含量。上清液中分泌蛋白的Westernblot顯示有特異性結合反應,大小約58kD,也與yG Ⅱ一致。這一結果表明TD區(qū)在蛋白質的成熟折疊過

12、程中確實影響了糖蛋白的空間結構和大小。
　　 基于重組微生物進入消化道后的治療理論,我們將兩組重組酵母pYes-G和pYes-InG分別灌胃小鼠,通過酵母存活率、免疫組化和血清ELISA等一系列指標檢測驗證口服重組活體酵母是否能刺激機體的免疫反應。
　　 首先,取0.5ml OD600=10.8的任一種高密度重組酵母灌胃小鼠(n=12),分別于消化后8小時和12小時采集小鼠小腸組織,稀釋小腸組織的提取液,鋪于孟加拉紅平板

13、上粗略計算酵母存活率。最終結果顯示,消化8小時后酵母存活率最高達36.11％,12小時后酵母最高存活率為0.59％,可以判斷重組酵母能抵制消化道內的酸、鹽和蛋白酶的破壞作用,在小腸大量定植并存活,這就為重組酵母釋放生物活性物質提供了機會,而這一存活時間也是檢測小鼠小腸中是否存在糖蛋白的最佳時機。
　　 其次,兩種重組酵母分別灌胃小鼠,灌胃時間為0d、7d、14d、21d、28d、35d和42d,并分別于28d,35d,42d灌胃

14、結束次日采集小鼠血清和小腸組織。免疫組化結果顯示,口服pYes-InG重組酵母的小鼠小腸組織中,能檢測到抗原物質G蛋白的存在,說明pYes-InG重組酵母在消化道中可以繼續(xù)進行分泌表達。相反,口服pYes-G重組酵母的小鼠小腸組織中,未能檢測到該抗原物質,但并不能說明pYes-G重組酵母在消化道體內無法完成釋放,其因為可能有兩點,其一,pYes-G重組酵母的表達量很低,根據CVS24-G蛋白胞內表達結果,重組蛋白中僅yGⅡ能與抗體發(fā)生特

15、異性反應,而這一蛋白僅占重組CVS24-G蛋白總量的1％,少量蛋白釋放后又會被快速分解,因而導致難以檢測；其二,盡管pYes-InG重組酵母的重組蛋白表達量略高于pYes-G重組酵母的yGⅡ蛋白,但因其是分泌表達,酵母可在消化道內持續(xù)分泌,直至細胞自溶破裂,因此及時的采集小腸組織樣本,進行免疫組化反應,完全有可能檢測到小腸組織中的狂犬病病毒糖蛋白。但這一外源物質能否被小腸M吞噬細胞識別,并進入淋巴細胞再循環(huán)過程刺激機體產生中和性抗體,還

16、需通過ELISA檢測小鼠體內的抗狂犬病的抗體滴度來判斷。
　　 第三,采集小鼠血液,進行ELISA。結果顯示,口服pYes-InG分泌型重組酵母的小鼠血液中產生了一定滴度的中和性抗體,而口服pYes-G重組酵母的小鼠血液中沒有產生中和性抗體,說明疫苗的免疫效果與外源活性物質的釋放有密切關聯；同時這一結果還表明,重組酵母在腸道分泌的蛋白顆粒可以被小腸M細胞吞噬,并由輸出淋巴管進入淋巴再循環(huán)過程,從而引起機體的免疫應答,然后誘導機體

17、產生抗體。這一結果確證了本實驗構建的分泌型重組酵母可以作為狂犬病疫苗,對狂犬病起到一定的預防作用。
　　 另外,ELISA結果還提示,經過5～6次的小鼠免疫接種后,小鼠體內產生的抗體基本恒定或呈緩慢增加趨勢,說明口服重組酵母疫苗仍為一種多劑量疫苗,需多次接種才有效果,而且抗體產生需要一定的時間,因此這類疫苗不適合對突發(fā)性狂犬病傳染進行控制或對狂犬病患者進行治療。
　　 總之,經過上述實驗環(huán)節(jié),我們成功構建了狂犬病口服疫苗