β-TrCP、β-catenin、IκBα在小鼠胚胎著床過程中子宮內膜的表達規(guī)律及意義.pdf

1、目的： 本研究運用RT-PCR、Western blotting、免疫組織化學以及激光掃描共聚焦顯微技術，檢測假孕、妊娠早期小鼠子宮內膜中β-TrCP及其所降解的靶蛋白β-catenin、IκBα基因與蛋白的表達、分布規(guī)律、動態(tài)變化以及對胚胎著床的影響，有助于從分子水平探討β-TrCP在胚胎著床過程中的分子調控機制，從而為了解人類正常生殖過程機制和生殖方面疾病的診斷、治療奠定基礎。 方法： 1.建立早孕及假孕NI

2、H小鼠動物模型，隨機將孕鼠分為7組作為實驗組，每組6只小鼠（其中D5需12只）。假孕小鼠作為對照組，收集妊娠D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7以及假孕小鼠子宮及內膜組織，-80℃凍存?zhèn)溆谩?2.采用臺盼蘭尾靜脈注射法分離子宮內膜胚胎著床點及其旁組織。 3.運用RT-PCR法檢測p-TrCP mRNA、β-catenin mRNA、IκBαmRNA在妊娠早期小鼠子宮內膜中的表達情況及動態(tài)變化規(guī)律。 4.運用免

3、疫組織化學技術以及Western blotting法檢測β-TrCP、β-catenin以及IκBα蛋白在妊娠早期小鼠子宮內膜中的表達情況及動態(tài)變化規(guī)律。 5.運用激光掃描共聚焦顯微技術檢測胚胎著床點及其旁組織β-TrCP以及IκBα蛋白的表達情況。 結果： 1.經尾靜脈注射臺盼蘭后，取出雙側子宮，可見條狀子宮呈現(xiàn)藍染帶。著床點被藍染，與非著床點區(qū)別明顯。 2.RT-PCR分析表明：各組小鼠子宮內膜均有β

4、-TrCP、β-catenin、IκBα mRNA的表達，并且存在時空表達差異。在妊娠D4時，β-TrCP表達水平達到最高峰，而β-catenin、IκBα表達水平降至最低。著床位點β-TrCP mRNA水平比旁組織顯著增強（p<0.05），而旁組織中IκBα mRNA水平比著床位點顯著增強（p<0.05）。 3.免疫組織化學結果顯示：β-TrCP、β-catenin、IκBα蛋白在妊娠早期以及假孕小鼠子宮中均有表達。從妊娠D1

5、開始，β-TrCP蛋白水平逐漸升高，至著床窗口期（D4）達最高水平（p<0.01），并維持到妊娠D5（p<0.05），以后其表達逐漸降低至正常水平。β-catenin、IκBα蛋白在著床前期一直維持在較高水平，與假孕對照組比較有顯著差異（p<0.05），但在著床窗口期（D4）明顯降低（p<0.05），之后又逐漸升高。β-TrCP蛋白主要集中在胞漿表達，妊娠D1至妊娠D3主要分布于腺上皮、腔上皮，妊娠D4以后集中在基質表達。β-caten

6、in、IκBα蛋白在胞漿、胞核中均有表達，但主要集中在基質表達，腺上皮、腔上皮表達較弱。 4.激光掃描共聚焦顯微技術分析顯示：β-TrCP、IκBα蛋白在假孕對照、胚胎著床位點及其旁組織中均有表達。著床位點、旁組織中β-TrCP、IκBα蛋白水平與假孕對照組比較有顯著差異（p<0.01），著床位點β-TrCP的蛋白水平與旁組織相比，顯著性增高（p<0.05）；相反，旁組織中IκBα蛋白水平與著床位點相比，顯著性增高（p<0.05

7、）。β-TrCP蛋白綠色熒光陽性信號主要分布在腺上皮、腔上皮的胞漿中，基質中亦有表達。IκBα蛋白紅色熒光陽性信號在腺上皮、腔上皮、基質的胞漿和胞核中均有表達。 5.Western blotting顯示：各樣本均于92kDa、60kDa、50kDa、40kDa處分別出現(xiàn)β-catenin、β-TrCP、內參Tubulin以及IκBα蛋白條帶。 結論： 1.β-TrCP、β-catenin、IκBα基因及其蛋白在假

8、孕以及妊娠早期小鼠子宮內膜中均有表達，并存在時空表達差異。 2.β-TrCP作為SCF（Skp1-Cull-F-box）復合物成員之一，參與磷酸化β-catenin、IκBα的泛素化降解。β-TrCP的高水平表達勢必造成胞漿中β-catenin、IκBα的較低水平；β-TrCP為Wnt/β-catenin信號通路的負性調節(jié)因子和NFκB通路的正性調節(jié)因子，β-TrCP在妊娠D4、D5維持較高水平這一事實與胚胎著床窗口期Wnt/β