低氧誘導因子1α在白蛋白過負荷致腎小管上皮細胞損傷中作用的研究.pdf

1、持續(xù)低氧狀態(tài)促進腎臟纖維化進展的觀點已被學界廣泛接受。低氧促進CKD進展的作用主要通過低氧誘導因子(Hypoxia inducible factor,HIF)/低氧反應元件(hypoxia responsive element,HRE)途徑。HIF-1是在低氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的特異性轉錄因子,由低氧敏感的α亞單位和結構性的β亞單位組成的異二聚體。HIF-1α在低氧條件下進入細胞核內(nèi),與β亞單位組成穩(wěn)定的HIF-1異二聚體,與HRE結合并啟

2、動靶基因轉錄而發(fā)揮生物學效應。持續(xù)穩(wěn)定表達HIF-1α的基因敲除小鼠腎臟纖維化加重,提示HIF-1α是一個新的調節(jié)腎臟纖維化的因子。
　　 傳統(tǒng)上認為蛋白尿是慢性腎臟病(Chronic Kideny Disease,CKD)進展的最重要危險因素之一,與CKD患者的生存率及腎存活率都有明確的相關性。持續(xù)蛋白尿可導致嚴重的小管間質損害及腎臟疾病的進展,做為蛋白尿的主要成分--白蛋白對小管間質損害起到?jīng)Q定性作用。腎小球疾病導致尿中增加

3、的白蛋白在腎小管重吸收和分解的過程中消耗大量能量,而由于腎臟本身結構的因素,腎小管所在區(qū)域的氧分壓又比較低,故臨床上低氧張力常同白蛋白過負荷同時存在,因此很自然考慮到白蛋白過負荷與低氧張力在促進腎臟纖維化方面是否存在某些聯(lián)系。事實上,HIF-1的很多下游基因在白蛋白過負荷誘導的腎小管上皮細胞損傷中發(fā)揮重要作用,如CTGF和TIMP-1等。自蛋白誘導腎小管上皮細胞表達CTGF和TIMP-1,進而促進膠原蛋白的合成,并抑制膠原蛋白的降解。<

4、br>　　 基于以上背景,本研究假設白蛋白通過HIF/HRE途徑啟動靶基因轉錄,發(fā)揮致腎小管上皮細胞損傷的作用,設計如下:首先在構建HRE-Luc報告基因質粒的基礎上,檢測無脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)對大鼠腎小管上皮細胞系(NRK-52E)HIF/HRE轉錄活性的影響；然后觀察BSA對NRK-52E細胞凋亡、前纖維化因子的合成和轉分化三個方面的影響,并應用RNAi技術沉默HIF-1α,深入探討HIF-1α在其中的作用。
　　

5、 第一部分研究BSA過負荷對腎小管上皮細胞HIF/HRE轉錄活性的影響
　　 目的應用HRE報告基因質粒檢測不同濃度白蛋白孵育不同時間對NRK-52E細胞HIF/HRE轉錄活性的影響。方法pGL3-Epo-HRE-uc報告基因質粒轉染的NRK-52E細胞在含BSA(0,5,10及20mg/ml)的培養(yǎng)基中孵育24h,48h及72h,雙熒光素酶法檢測各組的相對熒光強度,Western Blotting法檢測相應條件下HIF-1α

6、的表達。結果小劑量(5mg/ml)BSA孵育24h就能夠增加NRK-52E細胞的HIF/HRE轉錄活性,并且HIF/HRE轉錄活性隨BSA劑量增加和刺激時間延長而增強。BSA(20mg/ml)呈時間依賴性增強NRK-52E細胞HIF-1α蛋白表達。小結表明BSA增強腎小管上皮細胞HIF/HRE轉錄活性。
　　 第部分研究shRNAHIF-1α轉染對BSA過負荷致腎小管上皮細胞損傷的影響
　　 實驗一 shRNAHIF-1

7、α轉染對BSA過負荷致腎小管上皮細胞凋亡的影響
　　 目的探討B(tài)SA過負荷對NRK-52E細胞凋亡的影響及HIF-1α在其中的作用。
　　 方法 NRK-52E細胞在含不同濃度BSA的培養(yǎng)基中孵育不同時間的凋亡情況應用TUNEL和AnnexinV-FITC/PI雙染流式細胞學技術檢測,同時應用WesternBlotting方法檢測Bax蛋白表達。然后觀察應用shRNA沉默HIF-1α對NRK-52E細胞凋亡的影響。結果抗

8、BSA抗體與dUTP雙染細胞免疫熒光技術檢測到NRK-52E細胞在含BSA20mg/ml的培養(yǎng)基中發(fā)生凋亡細胞的位置與攝取BSA細胞的位置一致；流式細胞學技術檢測到低濃度BSA(Smg/ml)對NRK-52E細胞凋亡影響較小,而高濃度(>10mg/ml)長時間(>48h)刺激則顯著加重凋亡；WesternBlotting方法檢測NRK-52E細胞在BSA(20mg/ml,72h)刺激下總Bax蛋白表達無顯著改變,而6A7單克隆抗體檢測到

9、的活化Bax蛋白表達顯著增高。shRNA-Hiflα轉染細胞在BSA(20mg/ml,72h)刺激下的凋亡率和活化Ba)[蛋白表達顯著低于空質粒轉染的細胞。小結BSA誘導NRK-52E細胞凋亡需要較大濃度和較長刺激時間,HIF/HRE轉錄活性增加參與了較大劑量BSA誘導的NRK-52E細胞凋亡。
　　 實驗二shRNAHIF-1α轉染對BSA過負荷致腎小管上皮細胞前纖維化因子表達的影響
　　 目的探討巨噬細胞趨化因子-1

10、(MCP-1)、結締組織生長因子(CTGF)和組織型金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)等前纖維化因子在BSA誘導NRK-52E細胞合成細胞外基質中的作用,及HIF-1α在其中的作用。方法NRK-52E細胞在含不同濃度BSA的培養(yǎng)基中孵育不同時間,層粘連蛋白(FN)、MCP-1、CTGF和TIMP-1的表達應用Western Blotting、RT-PCR和ELISA等方法檢測。結果較低濃度BSA(5mg/ml)在較短的刺激時間(2

11、4h)即誘導NRK-52E細胞MCP-1蛋白高表達,BSA濃度愈高、刺激時間愈長,MCP-1表達愈高；在BSA10mg/ml刺激72h時,NRK-52E細胞FN,CTGF和TIMP-1的表達顯著高于BSA(0mg/ml)組。shRNA-Hiflα轉染細胞在BsA(10mg/ml,72h)刺激下FN,MCP-1,CTGF和TIMP-1的表達顯著低于空質粒轉染的細胞。小結BSA呈劑量和時間依賴性誘導NRK-52E細胞前纖維化因子和細胞外基質

12、蛋白的表達,并且這種作用部分通過HIF/HRE途徑實現(xiàn)。
　　 實驗三shRNAHIF-1α轉染對BSA過負荷致腎小管上皮細胞轉分化的影響目的探討B(tài)SA對NRK-52E細胞轉分化的影響,及HIF-1α在其中的作用。方法NRK-52E細胞在含不同濃度BSA的培養(yǎng)基中孵育不同時間,細胞間緊密連接(ZO-1)、α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉化生長因子β1(TGF-β1)的表達應用Western Blotting、RT-PCR和EL

13、ISA等方法檢測。結果在BSA10mg/ml刺激72h時,NRK-52E細胞ZO-1表達顯著高于BSA(0mg/ml)組,而α-SMA則顯著高于BSA(0mg/m1)組,shRNA-Hiflα轉染部分逆轉BSA的作用。在BSA10mg/ml刺激24h,48h和72h時,NRK-52E細胞TGF-β1蛋白含量都顯著高于BSA(0mg/ml)組,shRNA-Hiflα轉染細胞TGF-β1蛋白含量則顯著低于空質粒轉染對照組。小結較小劑量的BS