Racl-siRNA載體轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細胞的體外實驗.pdf

1、目的： 視網(wǎng)膜新生血管及其并發(fā)癥嚴重損害視功能，由于其發(fā)病機理尚未完全明了，因此目前仍無確切有效的藥物治療方法。缺氧條件下RPE細胞中VEGF表達增加對毛細血管內(nèi)皮的增殖起著重要的作用，提示RPE細胞可以作為抗視網(wǎng)膜新生血管生成基因治療的靶細胞，而研究表明Racl可能是調(diào)控多種血管生成相關(guān)因素的關(guān)鍵分子。本實驗通Racl-siRNA載體轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細胞的體外實驗，研究Racl對視網(wǎng)膜色素上皮細胞的作用，為進一步探討Racl

2、治療視網(wǎng)膜新生血管性疾病的可能性提供實驗性理論依據(jù)。 方法： ①常規(guī)培養(yǎng)RPE細胞，當細胞長至50％融合狀態(tài)時，加入脂質(zhì)體2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染載體，培養(yǎng)24h后觀察細胞的形態(tài)及轉(zhuǎn)染效率。 ②同法轉(zhuǎn)染載體后使用125umol/L的COCl<,2>行缺氧處理。 ③24h后熒光顯微鏡下觀測熒光，計算轉(zhuǎn)染效率；顯微鏡下觀測細胞的形態(tài)。 ④MTT法檢測對細胞增殖的影響。 ⑤使用RT-PCR及免疫細胞化

3、學(xué)方法檢測Racl、VEGF、HIF-1α和NF K-B的表達。 結(jié)果： ①Racl-siRNA載體體外轉(zhuǎn)染RPE細胞后觀察細胞，形態(tài)沒有明顯的改變，當載體的轉(zhuǎn)染濃度為3ug/L時轉(zhuǎn)染有較高的效率：15～20％。 ②以3ug/L的轉(zhuǎn)染濃度轉(zhuǎn)染RPE細胞，使用125umol/L的COCl<,2>行缺氧處理24h后，觀察細胞形態(tài)無明顯改變；轉(zhuǎn)染效率無明顯變化，為15～20％。 ③用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染對細胞的