葉酸對(duì)體外缺氧新生大鼠神經(jīng)干細(xì)胞Notch信號(hào)通路作用的研究.pdf

1、目的:研究葉酸(folic acid)對(duì)體外缺氧新生SD大鼠神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響,在分子水平上探討葉酸促進(jìn)腦缺血缺氧損傷神經(jīng)修復(fù)的作用及其機(jī)制。
　　 方法:通過(guò)機(jī)械吹打法獲得24h新生SD大鼠腦NSCs,利用含有bFGF和EGF因子的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,獲得NSCs并分為5組:①正常對(duì)照組(Controlgroup)葉酸濃度為4μg/ml；②缺氧模型組(Hypoxia mo

2、del group)葉酸濃度為4μg/ml；③缺氧葉酸低劑量組(Hypoxia+folic acid L group)葉酸濃度為8μg/ml；④缺氧葉酸高劑量組(Hypoxia+folic acid H group)葉酸濃度為44μg/ml；⑤缺氧葉酸缺乏組(Hypoxia+folic acid D group)葉酸劑量為0.65μg/ml；于增殖第3d將除正常對(duì)照組外的其他4組細(xì)胞進(jìn)行缺氧培養(yǎng),8h后取出,繼續(xù)培養(yǎng)至第7d收集增殖期細(xì)

3、胞；于增殖第7d,添加胎牛血清使細(xì)胞分化,繼續(xù)培養(yǎng)至第13d,收集分化期細(xì)胞。用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)缺氧損傷后的各組細(xì)胞密度；提取各組細(xì)胞總RNA進(jìn)行RT-PCR,采用實(shí)時(shí)定量SYBR Green I-PCR方法,檢測(cè)各組NSCsNotch信號(hào)通路相關(guān)基因(Notch1、Hes1、Hes5、Neurogenin1、Neurogenin2、Mash1)mRNA表達(dá)；采用Western blot方法檢測(cè)各組NSCs Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白(N

4、otch1、Hes1、Hes5)表達(dá)。
　　 結(jié)果:經(jīng)37℃,5％CO2、1％O2、94％N2條件缺氧8h后,NSCs形態(tài)及計(jì)數(shù)上都顯示出損傷跡象,成功建立體外新生SD大鼠NSCs缺氧損傷模型。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞密度結(jié)果顯示,缺氧模型組與其余四組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,缺氧葉酸高劑量組最高、缺氧葉酸缺乏組最低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。熒光定量PCR方法測(cè)定各組NSCs內(nèi)Notch信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)變化結(jié)果發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充葉酸能上調(diào)

5、Notch1、Hes1/5基因的表達(dá),正常對(duì)照組于增殖第7d、分化第7d三種基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于缺氧模型組,缺氧葉酸高劑量組于增殖第7d、分化第7d三種基因mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于缺氧模型組；另外本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充葉酸能下調(diào)Mash1、Neurgenin1/2基因的表達(dá),增殖第7d和分化第7d缺氧模型組Mash1、Neurgenin1/2 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于葉酸補(bǔ)充組,缺氧葉酸低劑量組高于缺氧葉酸高劑量組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

6、。Western blot方法測(cè)定各組NSCs內(nèi)Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示,增殖第7d,Notch1、Hes1/5蛋白,正常對(duì)照組表達(dá)量均高于缺氧模型組,缺氧葉酸高劑量組表達(dá)量最高,缺氧葉酸低劑量組表達(dá)量最低；分化第7d,各組NSCsNotch1、Hes5蛋白表達(dá)量均較增殖第7d有所下降,Hes1蛋白表達(dá)量則較增殖第7d有所增加,但三種蛋白表達(dá)具有相似之處,即正常對(duì)照組高于缺氧模型組,缺氧葉酸高劑量組高于其他各組,缺氧葉酸