肝癌靶向SEA-CD80共表達重組腺病毒的構建.pdf

1、原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)的肝癌患者約45％發(fā)生在我國大陸地區(qū)，而且近年來發(fā)病率又有增高趨勢，統(tǒng)計表明我國肝癌的年死亡率為20.40/10萬，在城市和農村分別占惡性腫瘤死亡率的第一和第二位?，F(xiàn)有的手術方法不能完全切除癌細胞；放、化療等傳統(tǒng)方法也不利于癌癥的徹底治療。隨著腫瘤生物治療技術的不斷發(fā)展，基因治療作為肝癌生物治療的一個重要手段越來越受到重視。充分發(fā)揮機體的自身力量，如免疫功能治療癌癥是一條具有十分廣闊前景

2、的“綠色通道”?；蛑委熢谶M入臨床應用前必須解決組織和細胞特異性問題，以減少副作用。此外，由于肝癌細胞免疫原性弱，MHC分子、表面共刺激分子表達低下或缺乏，以及抑制自體腫瘤免疫等因素，現(xiàn)有的免疫治療往往不能誘導有效的免疫應答，致使癌細胞能夠逃避免疫系統(tǒng)的識別和攻擊。超抗原無需抗原遞呈細胞的加工，而是以完整的蛋白分子直接與抗原遞呈細胞的MHC-II及T細胞受體（TCR）結合，從而激活大量的T細胞。金黃色葡萄球菌腸毒素A作為一種超抗原物質，

3、應用于人類腫瘤治療已有報道。CD80是一個重要的輔助刺激分子，通過與T細胞表面的CD28結合提供細胞活化所需的第二信號，刺激T細胞活化。
　　在本研究中，我們以AFP啟動子和增強子為調控元件、以共表達CD80和穿膜型葡萄球菌腸毒素A基因為目的基因，以Ad5腺病毒為載體構建了以AFP為肝癌靶向調控SEA/CD80共表達的重組腺病毒，為肝癌的免疫基因治療的進一步實驗奠定了基礎。
　　1.攜帶人AFP啟動子和增強子序列的腺病毒穿梭

4、質粒的構建
　　目的：構建甲胎蛋白（AFP）啟動子/增強子基因調控的腺病毒穿梭載體。方法：設計相關引物，利用實驗室保存的人肝基因組DNA為模板，經PCR方法，獲得AFP基因的啟動子和增強子片段。利用本實驗室之前改建好的pShuttle2穿梭載體，經連接、轉化、提取質粒等步驟構建目的穿梭載體pShuttle-AFP。結果：經酶切鑒定和基因測序等方法鑒定，所克隆的AFP啟動子和增強子序列與Genebank中公布的相關序列一致。酶切鑒定

5、結果與預期結果一致。結論：我們成功構建了攜帶AFP啟動子和增強子的腺病毒穿梭質粒pShuttle-AFP，為下一步肝癌特異性調控治療基因的構建做好基礎。
　　2.AFP增強子和啟動子調控的SEA-CD80共表達腺病毒穿梭質粒的構建
　　目的：構建AFP增強子和啟動子調控的SEA-CD80基因共表達穿梭腺病毒載體。方法：首先設計SEA和CD80目的片段的引物，分別以葉菁博士構建的pMD18-tmSEA載體和人肝cDNA為模板，

6、經PCR方法獲得穿膜型SEA（tmSEA）和CD80的目的基因片段；將tmSEA片段連接入pIRES2-EGFP載體，構建pIRES2-EGFP-SEA。利用免疫熒光方法檢測穿膜型SEA的亞細胞定位。將CD80片段連接入pMD18-T載體，分別經連接、轉化等步驟構建pMD18-T-CD80，構建完成的質粒經酶切鑒定正確的質粒送生物公司測序。將測序正確的pMD18-T-CD80質粒經雙酶切，取得CD80目的片段。測序正確的pIRES2-E

7、GFP-SEA質粒經雙酶切，獲得SEA-IRES片段與CD80克隆到pShuttle-AFP載體，構建目的載體pShuttle-AFP-SEA-CD80。結果：所克隆的SEA和CD80序列與Genebank中公布的相關序列一致。所有的酶切結果與預期結果一致。以構建好的穿梭質粒為模板，所有片段的引物為相關引物，PCR得到的結果與預期結果一致。同時，利用免疫熒光確定穿膜型SEA能夠定位到細胞膜表面。結論：我們成功構建了以AFP基因為靶向調控

8、的SEA-CD80基因共表達真核腺病毒載體。
　　3.肝癌靶向SEA-CD80共表達重組腺病毒的構建
　　目的：構建AFP基因調控的SEA-CD80基因共表達重組腺病毒。方法：采用AdEasyTM腺病毒制備系統(tǒng)將實驗二中構建的穿梭載體pShuttle-AFP-SEA-CD80經PmeI單酶切線性化后，與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1共轉化E.coliBJ5183。構建pAd-AFP-SEA-CD80重組腺病毒質粒。采用Pa

9、cI線性化pAd-AFP-SEA-CD80，轉染AD293包裝細胞，獲得由AFP增強子和啟動子調控的共表達SEA和CD80的重組腺病毒，并擴增。將腺病毒感染表達AFP的HepG2細胞，利用Westernblot檢測目的基因的表達。結果：所構建的pAd-AFP-SEA-CD80重組腺病毒載體，經PacI酶切鑒定獲得大小為3.5kDa和4.5kDa的預期目的片段，以重組載體為模板，所有片段的引物為相關引物，PCR得到的結果與預期結果一致。該

10、腺病毒感染肝細胞癌HepG2后，能夠特異性地檢測到目的基因tmSEA和CD80的表達。結論：我們成功構建了以AFP啟動子/增強子為靶向調控的SEA-CD80基因共表達重組腺病毒載體，并能夠在HepG2細胞中特異性地表達目的基因tmSEA和CD80。為肝癌特異性調控免疫基因治療劑的制備奠定基礎。
　　本研究成功的從人肝基因組DNA中克隆到人甲胎蛋白（AFP）的啟動子和增強子序列，成功構建了AFP啟動子順式調控序列調控的腺病毒穿梭質粒

11、pShuttle-AFP；成功地構建了穿膜型SEA，克隆了CD80基因，并將二者克隆到構建的pShuttle-AFP，成功構建了pShuttle-AFP-SEA-CD80穿梭質粒；采用AdEasyTM腺病毒制備系統(tǒng)將構建好的pShuttle-AFP-SEA-CD80穿梭載體，與腺病毒骨架質粒pAdEasy-1進行重組，構建pAd-AFP-SEA-CD80重組腺病毒載體。利用包裝細胞，制備了AFP啟動子調控的共表達穿膜型SEA和CD80分