缺血心肌microRNAs的表達變化以及microRNA-378的保護效應(yīng)研究.pdf

1、一、研究背景
　　 冠心病心肌缺血和心肌梗死是臨床的常見病和多發(fā)病，目前研究對于內(nèi)源性因子在心肌缺血中的功能作用及機制尚缺乏認識。microRNAs(miRNAs)是新發(fā)現(xiàn)的一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)活性的重要內(nèi)源性因子，能夠按照堿基互補配對原則與靶mRNA的3'端非編碼區(qū)序列相互識別，引起靶mRNA的降解和/或翻譯抑制。生物信息學分析顯示，一個miRNA分子的潛在靶mRNA可能有上百個，提示了miRNA生物學功能的多樣性與復(fù)雜性。在心

2、肌缺血狀態(tài)下，miRNAs的變化很可能影響多種靶蛋白的表達，繼而影響缺血心肌的結(jié)構(gòu)和功能。目前有關(guān)miRNAs與心肌缺血的認識尚局限在極個別miRNAs，而絕大多數(shù)miRNAs的表達變化、功能意義以及作用機制仍屬未知。
　　 本課題通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立整體大鼠急性心肌缺血模型，通過miRNA微陣列技術(shù)和real-time PCR技術(shù)檢測了大鼠急性缺血心肌中miRNAs的表達變化，篩選出了差異表達顯著的miRNAs；并且，

3、在培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細胞株，構(gòu)建低氧損傷模型(1％O2-94％N2-5％CO2)，確認差異表達的miRNAs在該心肌細胞模型的表達變化。應(yīng)用人工合成的特異性mimics或inhibitor轉(zhuǎn)染H9c2細胞，使得相應(yīng)的miRNA過表達或者低表達，并觀察對H9c2細胞損傷和凋亡的影響，從而篩選出能有效減輕缺血性心肌損傷的miRNAs；最后，通過對該miRNAs潛在靶蛋白的預(yù)測和干預(yù)來探討其作用機制。本工作有助于認識miRNAs在心肌缺血

4、中的作用及機制，并為防治和減輕心肌缺血性損傷提供新的研究資料和實驗依據(jù)。
　　 二、模型與方法
　　 1.大鼠急性心肌缺血模型
　　 通過結(jié)扎大鼠冠狀動脈左前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)建立急性心肌缺血模型。取成年雄性SD大鼠(220-280g)20只，隨機分為假手術(shù)組和手術(shù)組，每組各10只。經(jīng)20％尿酯(5ml/kg)麻醉后，將大鼠仰臥位固定在

5、手術(shù)臺上，行氣管插管術(shù)和機械通氣，開胸暴露心臟，以絲線環(huán)繞冠狀動脈左前降支(leftanterior descending coronary artery，LAD)，穩(wěn)定15min。手術(shù)組大鼠結(jié)扎LAD，4 h后取缺血區(qū)心肌。假手術(shù)對照組大鼠的所有手術(shù)過程相同，但不結(jié)扎LAD，4 h后取“假”缺血區(qū)心肌。采用miRNAs芯片雜交或real-time PCR法測定所取心肌組織中miRNAs的表達水平。
　　 2.培養(yǎng)的心肌細胞低氧

6、損傷模型
　　 將常規(guī)培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細胞系進行無血清處理12h以使細胞同步化，然后繼續(xù)置于無血清培液中，在1％O2-94％N2-5％CO2低氧氣體環(huán)境中培養(yǎng)24h制備低氧損傷模型，以無血清常氧培養(yǎng)作為對照。24h后收集細胞及細胞上清。測定細胞上清液乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量以評價細胞損傷程度，MTT法測定細胞活力，Annexin

7、 V-FITC/PI雙標記后行流式細胞術(shù)測定細胞凋亡。此外，收獲細胞抽提總RNA，通過real-time PCR法檢測miRNAs的表達變化。
　　 3.MicroRNA芯片雜交分析
　　 取急性心肌缺血大鼠和對照大鼠心肌組織樣本，抽提總RNA后通過測定OD260/OD280比值和甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測RNA質(zhì)量，然后進行miRNAs的分離、熒光標記和芯片雜交實驗，芯片雜交實驗和數(shù)據(jù)分析由美國LC Sciences

8、公司完成。最后篩選出大鼠急性心肌缺血模型中異常表達的miRNAs。
　　 4.MicroRNAs表達檢測
　　 通過實時熒光定量PCR法檢測心肌組織和培養(yǎng)的H9c2心肌細胞中miRNAs的含量：常規(guī)方法抽提RNA，通過莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性引物反轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的靶miRNA，然后進行實時熒光定量PCR檢測，以GAPDH作為內(nèi)參照基因，通過標準曲線法定量，分析各樣本的miRNA含量，并通過溶解曲線和瓊脂糖凝膠電泳確定基因擴增的特異性。

9、
　　 5.MicroRNA過表達和低表達干預(yù)實驗
　　 將人工合成的miRNA模擬物(mimic)或阻遏物(inhibitor)在脂質(zhì)體(siport neofxtransfection agent)輔助下轉(zhuǎn)染H9c2細胞，使得相應(yīng)的靶miRNA高表達或者低表達，觀察對H9c2細胞低氧損傷和凋亡的影響。實驗分組如下：(1)常氧培養(yǎng)組；(2)低氧培養(yǎng)組；(3)轉(zhuǎn)染miRNA mimics常氧培養(yǎng)組；(4)轉(zhuǎn)染miRNA

10、inhibitor常氧培養(yǎng)組；(5)轉(zhuǎn)染miRNA mimics低氧培養(yǎng)組；(6)轉(zhuǎn)染miRNA inhibitor低氧培養(yǎng)組。
　　 6.生物信息學方法預(yù)測MicroRNA的靶基因
　　 利用TargetScan、Bibiserve、Pictar等microRNAs靶基因預(yù)測網(wǎng)站和軟件，對大鼠的miRNA的二級結(jié)構(gòu)和靶基因進行預(yù)測分析，尋找序列匹配程度高、二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、靶序列在物種間高度保守的基因進行后續(xù)驗證。將人工合

11、成的miRNA mimic或inhibitor在脂質(zhì)體輔助下轉(zhuǎn)染H9c2細胞，使得相應(yīng)的靶miRNA高表達或者低表達，通過Western blot分析靶蛋白表達量，以確定miRNA在細胞中能否調(diào)控靶基因表達。
　　 三、結(jié)論
　　 1.在整體大鼠LAD結(jié)扎所致急性缺血心肌模型，缺血4h后，心肌中多種miRNAs的表達發(fā)生變化，其中miR-378的表達下調(diào)42％。在培養(yǎng)的大鼠H9c2心肌細胞系，低氧培養(yǎng)(1％O2)24h所

12、引起的miRNAs表達變化與在體心肌缺血所引起的變化相似，其中miR-378的表達下調(diào)44％。
　　 2.在培養(yǎng)的H9c2細胞，過表達miR-378能夠減輕缺氧所致細胞損傷和凋亡，相反，miR-378表達缺陷則加重缺氧所致細胞損傷和凋亡。該結(jié)果表明，miR-378在缺氧/血狀態(tài)下具有抑制凋亡、保護心肌的效應(yīng)。
　　 3. MiR-378抑制凋亡、保護心肌的效應(yīng)很可能是通過抑制靶蛋白CASP3的表達而實現(xiàn)的，有待進一步實驗