MAPKs信號(hào)通路在LPS調(diào)控的人根尖乳頭細(xì)胞成牙本質(zhì)-成骨向分化過(guò)程中的作用.pdf

1、目的：
　　細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是誘發(fā)根尖周炎的強(qiáng)烈毒力因子。在壞死牙髓組織中可以檢測(cè)到LPS，細(xì)菌產(chǎn)生的LPS具有很強(qiáng)的滲透性，容易經(jīng)過(guò)根尖孔滲透進(jìn)入根尖周組織從而導(dǎo)致根尖周發(fā)生病變。在年輕恒牙中，因畸形、齲壞、外傷等因素導(dǎo)致的牙髓根尖周病變，細(xì)菌及其內(nèi)毒素LPS會(huì)接觸刺激根尖乳頭組織中的人根尖乳頭細(xì)胞(human dental apical papillacells,HAPCs)，該

2、細(xì)胞生物學(xué)行為不可避免地受到炎性因子LPS的影響。本研究意在探究LPS對(duì)人根尖乳頭細(xì)胞增殖及分化的影響及MAPKs信號(hào)通路在LPS調(diào)控的人根尖乳頭細(xì)胞分化過(guò)程中的作用。
　　方法與結(jié)果：
　　第一部分:人根尖乳頭細(xì)胞分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)礦化
　　酶消化法分離培養(yǎng)人根尖乳頭細(xì)胞，細(xì)胞的增殖能力強(qiáng)，生長(zhǎng)曲線呈S形。礦化誘導(dǎo)21d，同對(duì)照組相比，礦化誘導(dǎo)組茜素紅染色呈紅褐色，鏡下見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)多且深染。
　　第二部分:LPS對(duì)人

3、根尖乳頭細(xì)胞增殖及成牙本質(zhì)/成骨向分化的影響
　　采用不同濃度的LPS作用于人根尖乳頭細(xì)胞，分別應(yīng)用MTT法和堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)LPS對(duì)人根尖乳頭細(xì)胞增殖及堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性的影響;結(jié)果顯示低濃度的LPS對(duì)細(xì)胞增殖及ALP活性均有促進(jìn)作用。進(jìn)一步用低濃度LPS作用于細(xì)胞，茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)的形成，real-time PCR檢測(cè)礦化相關(guān)標(biāo)記物牙本質(zhì)涎磷蛋白(dentinsialop

4、hosphoprotein，DSPP)、成骨相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子(runt-relatedtranscription factor2，Runx2)、骨涎蛋白(bone sialoprotein，BSP)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)基因水平的表達(dá)。結(jié)果顯示LPS作用于細(xì)胞7d后礦化結(jié)節(jié)的形成與對(duì)照組相比無(wú)差異;礦化相關(guān)標(biāo)記物DSPP、BSP、Runx2的表達(dá)上調(diào)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，OCN表達(dá)未上調(diào)。14d后LPS刺激組礦化結(jié)節(jié)形

5、成增多，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;礦化相關(guān)標(biāo)記物DSPP，RUNX2、BSP、OCN均有升高，其中DSPP、RUNX2、BSP與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。21d后LPS刺激組礦化結(jié)節(jié)的形成與對(duì)照組無(wú)差異;礦化相關(guān)標(biāo)記物Runx2的表達(dá)上調(diào)且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，DSPP、BSP、OCN表達(dá)未上調(diào)。以上結(jié)果提示，低濃度的LPS很可能在人根尖乳頭細(xì)胞成牙本質(zhì)/成骨向分化過(guò)程中起正向調(diào)控作用。第三部分:MAPKs信號(hào)通路在LPS調(diào)控人

6、根尖乳頭細(xì)胞成牙本質(zhì)/成骨向分化過(guò)程中的作用
　　應(yīng)用Western Blot檢測(cè)LPS作用于人根尖乳頭細(xì)胞后MAPKs信號(hào)通路蛋白磷酸化水平的變化。結(jié)果顯示，LPS促進(jìn)ERK和p38的磷酸化，表明LPS可以激活ERK和p38MAPK信號(hào)通路。ERK通路抑制劑U0126/p38MAPK通路抑制劑SB203580和LPS聯(lián)合作用于細(xì)胞后，通過(guò)real-time PCR和Western Blot分別檢測(cè)礦化相關(guān)因子DSPP、Runx2

7、、BSP基因及蛋白水平的表達(dá)。利用堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)ALP的活性。結(jié)果顯示，抑制ERK和p38MAPK信號(hào)通路后，人根尖乳頭細(xì)胞的ALP活性降低;DSPP、Runx2、BSP基因及蛋白水平的表達(dá)量均有所降低且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明抑制ERK和p38MAPK信號(hào)通路可降低LPS調(diào)控的人根尖乳頭細(xì)胞成牙本質(zhì)/成骨向分化。
　　結(jié)論：
　　低濃度的LPS可促進(jìn)人根尖乳頭細(xì)胞的增殖及牙本質(zhì)/成骨向分化;同時(shí)LPS能夠激活