BTLA與HVEM相互作用對T細胞免疫應答的調(diào)節(jié).pdf

1、T細胞的活化需要雙信號的刺激，T細胞抗原受體特異性識別MHC/抗原肽產(chǎn)生第一信號，共刺激分子的活化產(chǎn)生第二信號。共刺激分子和共抑制分子統(tǒng)稱為共信號分子。免疫球蛋白超家族（IgSF）中的共刺激分子CD28和ICOS具有促進T細胞活化的作用，而共抑制分子CTLA-4、PD-1和新近發(fā)現(xiàn)的B淋巴細胞和T淋巴細胞衰減子（B and T lymphocyte attenuator， BTLA）具有抑制T細胞的作用。 BTLA分子具有IgS

2、F的結(jié)構(gòu)特征，胞外段包含一個免疫球蛋白可變區(qū)樣結(jié)構(gòu)域（IgV），胞內(nèi)含有兩個免疫受體酪氨酸抑制性基序（ITIMs）。ITIMs磷酸化，可以募集酪氨酸磷酸酶SHP-1和SHP-2，產(chǎn)生抑制效應。BTLA在小鼠B淋巴細胞上表達量很高，T淋巴細胞和DC上的表達次之，巨噬細胞的表達在不同小鼠中具有多態(tài)性，NK細胞表達很少。在T細胞活化過程中，BTLA表現(xiàn)出和CTLA-4、PD-1不同的調(diào)節(jié)模式。CTLA-4和PD-1誘導活化后表達在T細胞上，B

3、TLA組成性表達在T細胞表面，活化后維持高水平表達。研究表明，BTLA可以抑制T細胞的增殖及IL-2和IFNγ的分泌，BTLA-/-T細胞對DC提呈的抗原刺激增殖更明顯。盡管BTLA屬于IgSF成員，然而其配體卻是TNFR家族的HVEM。這是兩大家族相互作用的唯一分子對，更特別的是，BTLA具有抑制T細胞的功能，而HVEM卻可以活化NF-κB和AP-1，增強T細胞反應。HVEM表達在靜止T細胞和未成熟DC細胞上，隨著T細胞活化和DC的成

4、熟，表達降低，HVEM和FNF家族配體LIGHT結(jié)合，可以下調(diào)HVEM的表達。用LIGHT刺激HVEM能夠維持T細胞的存活和炎癥反應。然而，表達在抗原提呈細胞上的HVEM和HVEM-Fc融合蛋白和T細胞上的BTLA結(jié)合后，產(chǎn)生抑制T細胞的作用。小鼠的研究表明，BTLA信號可以防止自身免疫性疾病的發(fā)生，終止炎癥反應，抑制移植免疫應答，因此，BTLA信號在外周免疫耐受的調(diào)節(jié)中，具有重要作用。 BTLA/HVEM/LIGHT的表達和作

5、用方式，構(gòu)成了復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，連接了IgSF和TNFR兩大家族的信號，因此是T細胞精確而又細微的調(diào)節(jié)自身活化的重要機制，在適時終止過度激活的免疫應答中具有重要作用。 本研究首先分析了BTLA在人T細胞活化的起始和早期階段免疫應答中的調(diào)節(jié)作用。進而以人Treg細胞作為研究對象，揭示了BTLA信號是Treg細胞發(fā)揮抑制T細胞免疫應答的新途徑。最后以表達人HVEM的基因轉(zhuǎn)染細胞免疫小鼠，成功研制了一株鼠抗人HVEM的單克隆抗體。

6、 第一部分、交聯(lián)鼠抗人BTLA單抗或HVEM-Fc融合蛋白介導BTLA對T細胞活化的抑制。 目的：利用鼠抗人BTLA單克隆抗體8H9和HVEM-Fc融合蛋白的不同作用方式，觀察它們對T細胞的作用，為探討B(tài)TLA在T淋巴細胞上的功能提供研究手段。 方法：分離人外周血單個核細胞，經(jīng)陰性選擇磁珠分離純化獲得T淋巴細胞，流式細胞術檢測BTLA在不同T淋巴細胞亞群上的表達。進一步用PHA或激發(fā)型抗人CD3單抗包板刺激T淋巴細胞活

7、化，MTT法檢測游離、包被以及抗Fc段二抗交聯(lián)的8H9或HVEM-Fc融合蛋白對T淋巴細胞增殖的抑制作用。 結(jié)論：BTLA單抗8H9及HVEM-Fc融合蛋白經(jīng)包被或抗Fc段二抗交聯(lián)后可以介導BTLA對T細胞活化的抑制作用，但游離在液體中則不能激發(fā)BTLA信號，利用這一生物學特性為進一步研究BTLA對T細胞免疫應答的調(diào)節(jié)作用提供了有效的手段。 第二部分、BTLA對T細胞活化的起始和早期階段免疫應答的調(diào)節(jié)。 目的：觀

8、察BTLA在T細胞上的表達并探討其在各個階段不同時相對T細胞活化的抑制。 方法：分離人外周血單個核細胞，經(jīng)陰性選擇磁珠分離純化獲得T淋巴細胞。流式檢測新鮮分離T細胞上BTLA、HVEM、LIGHT、CTLA-4和PD-1的表達；用CD3抗體刺激T細胞活化，比較BTLA、CTLA-4和PD-1在T細胞活化過程中的動態(tài)表達。CD3抗體在加入或不加入BTLA單抗8H9的情況下刺激T細胞活化，流式細胞術檢測早期活化標志分子CD25和CD

9、69的表達。CD3抗體單獨或聯(lián)合CD28抗體活化T細胞，在不同的活化時間，MTT檢測BTLA單抗8H9對T細胞增殖的影響。外周血單個核細胞經(jīng)貼壁，GM-CSF和IL-4體外誘導生成未成熟DC，CD40抗體刺激DC成熟，流式檢測HVEM在DC上的表達。用DC誘導異基因T細胞活化，加入游離8H9或抗HVEM抗體，阻斷HVEM和BTLA結(jié)合，MTT檢測T細胞增殖。 結(jié)論：BTLA可以提高T細胞的活化閾值，抑制T細胞早期活化分子CD25

10、和CD69的表達，在T細胞活化的起始和早期階段發(fā)揮重要的負性調(diào)控作用。 第三部分、HVEM在人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞上的表達及功能研究。 目的：研究HVEM在人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞上的表達及其對Treg細胞功能的影響。 方法：分離人外周血單個核細胞，磁珠純化獲得T細胞及其不同亞群，流式細胞術檢測CD3+T細胞和Treg細胞上HVEM的表達。用CD3抗體分別活化CD3+T細胞或Treg

11、細胞，流式檢測HVEM的動態(tài)表達。Treg細胞按不同比例分別與去除Treg細胞的CD3+T細胞、CD4+CD25-T細胞或CD8+T細胞混合培養(yǎng)，加入抗HVEM抗體或同型對照抗體，并用CD3抗體單獨或聯(lián)合CD28抗體刺激T細胞，MTT檢測T細胞增殖。 結(jié)論：HVEM在Treg細胞上高表達介導了Treg細胞對效應T細胞的抑制功能，是Treg細胞通過細胞之間直接接觸發(fā)揮抑制作用的又一新分子。 第四部分、鼠抗人HVEM單克隆抗

12、體的研制。 目的：研制鼠抗人HVEM單克隆抗體，為探討HVEM/BTLA相互作用對人T細胞的抑制性調(diào)節(jié)提供研究手段。 方法：以高表達人HVEM的轉(zhuǎn)基因細胞L929/HVEM為免疫原，常規(guī)免疫BALB/c小鼠，采用B淋巴細胞雜交瘤技術進行細胞融合，并以轉(zhuǎn)基因細胞L929/HVEM和L929/mock分別作為陽性和陰性篩選細胞。采用間接免疫熒光標記法流式細胞術篩選雜交瘤克隆。經(jīng)多次克隆化培養(yǎng)，獲得特異性分泌鼠抗人HVEM分子

13、單克隆抗體的雜交瘤細胞株。采用細胞核染色體計數(shù)、Ig亞類快速定性試紙法對所獲雜交瘤和單抗進行鑒定。用間接免疫熒光法初步分析單抗與T細胞及DC上HVEM的結(jié)合反應，并用MTT法檢測其對Treg細胞抑制效應T細胞增殖的影響。 結(jié)論：成功獲得1株穩(wěn)定分泌鼠抗人HVEM單克隆抗體的雜交瘤細胞株，從而為研究HVEM/BTLA抑制信號對T細胞的調(diào)節(jié)作用提供了物質(zhì)手段。 綜上所述，本研究應用BTLA單抗8H9和HVEM-Fc融合蛋白模

14、擬BTLA信號，表明包被和交聯(lián)的單抗或Fc融合蛋白可以激發(fā)BTLA信號，而游離在液體中，不能產(chǎn)生抑制信號，這為研究BTLA的功能提供了手段；BTLA信號能抑制T細胞早期活化分子CD25和CD69的表達，提高T細胞活化閾值，并在T細胞活化的48h內(nèi)可以發(fā)揮抑制作用，即T細胞活化的起始和早期階段發(fā)揮抑制作用，這有助于更全面和深入地理解負性信號分子在免疫應答中的作用和地位；CD4+CD25+Treg細胞高表達HVEM，并且HVEM/BTLA相