骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)于髓核細(xì)胞炎性損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:在椎間盤(pán)退行性病變過(guò)程中，椎間盤(pán)內(nèi)微環(huán)境中IL-1β表達(dá)的升高被認(rèn)為是其重要的致病因素，而間充質(zhì)干細(xì)胞治療椎間盤(pán)退行性病變也被認(rèn)為是具有巨大潛力的治療策略。在眾多實(shí)驗(yàn)中間充質(zhì)干細(xì)胞都表現(xiàn)出良好的髓核細(xì)胞分化特性，以及體外實(shí)驗(yàn)中良好的恢復(fù)椎間盤(pán)高度的能力，本實(shí)驗(yàn)將從體外評(píng)價(jià)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)對(duì)白介素1β(IL-1β)干預(yù)后的髓核(NP)細(xì)胞保護(hù)修復(fù)能力。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定以及實(shí)驗(yàn)

2、分組。一型膠原，二型膠原的細(xì)胞免疫組化鑒定。取三代BMSCs通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行CD29、CD31、CD45、CD90位點(diǎn)鑒定細(xì)胞純度。實(shí)驗(yàn)共分為三組:1.對(duì)照組:在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下24 h后更換為含有完全培養(yǎng)基24h。2.炎性干預(yù)組（A組）:在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下加入IL-1β(20ng/ml)干預(yù)24h后更換為含有完全培養(yǎng)基24h。3.共培養(yǎng)組（B組）:在無(wú)血清培養(yǎng)基條件下加入IL-1β(20ng/ml)干預(yù)24h后，更換含有完全培養(yǎng)

3、基同時(shí)置入預(yù)先種入BMSCs細(xì)胞的transwell小室，共培養(yǎng)24h，三組實(shí)驗(yàn)都分為2個(gè)階段，時(shí)間各24h。
　　2.Realtime-PCR: BMSCs非接觸共培養(yǎng)下炎性干預(yù)的NP細(xì)胞中基因的表達(dá)。采用Realtime-PCR檢測(cè)三組獲得NP細(xì)胞的ADAMTS-4、5、7，MMP-3、13，TIMP-1的基因相對(duì)表達(dá)量。
　　3.細(xì)胞凋亡的檢測(cè):根據(jù)beyotime提供的Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)于三組

4、細(xì)胞CASPASE-3的活性進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)還對(duì)于三組細(xì)胞進(jìn)行TUNEL染色，觀察三組細(xì)胞的TUNEL染色的活性，進(jìn)行比較。BMSCs非接觸共培養(yǎng)下炎性干預(yù)的NP細(xì)胞凋亡比例變化。取各組NP細(xì)胞，使用Annexin V(PE)/PI流式試劑盒檢測(cè)凋亡的變化。在流式檢測(cè)中，加入直接共培養(yǎng)（C組），使用相同數(shù)量的GFP-BMSCs直接加入炎性因子損失的NP細(xì)胞中，觀察四組髓核細(xì)胞凋亡數(shù)量的變化。
　　4.細(xì)胞遷徙的檢測(cè):對(duì)于0ng/ml

5、，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml濃度的IL-1β干預(yù)髓核細(xì)胞24h，將transwell板由換成8-μm孔徑的濾板，通過(guò)四組的比較，觀察BMSCs對(duì)于炎性損傷的NP細(xì)胞的遷徙能力。
　　5.線粒體染色現(xiàn)象觀察:使用24孔提前鋪片，使用IL-1β(20ng/ml)干預(yù)NP細(xì)胞24h之后，加入使用帶有GFP熒光的BMSCs，GFP-BMSCs使用線粒體染料預(yù)染色，直接接觸共培養(yǎng)24h后，將細(xì)胞玻片取出在共聚焦顯微鏡下觀

6、察。
　　結(jié)果:
　　1.NP細(xì)胞、BMSCs純度鑒定。BMSCs傳至第3代通過(guò)流式細(xì)胞儀通過(guò)CD29、CD31、CD45、CD90位點(diǎn)鑒定細(xì)胞純度，BMSCs的流式鑒定結(jié)果顯示90％以上的BMSCs表現(xiàn)為CD29，CD90陽(yáng)性，小于5％的BMSCs的CD31及CD45陽(yáng)性，細(xì)胞純度較好。髓核細(xì)胞免疫組化顯示的二型膠原表達(dá)較好，符合NP細(xì)胞的膠原表達(dá)特點(diǎn)。
　　2.Realtime-PCR結(jié)果，相比于對(duì)照組，A組中AD

7、AMTS-4，ADAMTS-5，ADAMTS-7，MMP-13，MMP-3表達(dá)顯著升高，五組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。而相比A組，B組各項(xiàng)退變指標(biāo)基因表達(dá)量顯著降低，五組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05）。
　　3.細(xì)胞凋亡檢測(cè):三組細(xì)胞TUNEL染色顯示炎性刺激組（A組）髓核細(xì)胞凋亡明顯增加，BMSCs共培養(yǎng)組（B組）對(duì)于炎性因子導(dǎo)致的凋亡細(xì)胞的數(shù)量的增產(chǎn)生有效的抑制。在Caspase-3的檢測(cè)中，A組比較

8、對(duì)照組caspase-3活性升高明顯，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05），而相比于A組，B組中Caspase-3活性下降，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。AnnexinⅤ(PE)/PI流式結(jié)果，與對(duì)照組相比，A組NP細(xì)胞在炎性因子刺激下凋亡增加明顯，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。經(jīng)過(guò)BMSCs間接共同培養(yǎng)（B組）后，相比于A組，NP細(xì)胞凋亡下降明顯，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。AnnexinⅤ(

9、PE)/PI流式結(jié)果中，直接共培養(yǎng)的結(jié)果（C組）和間接共培養(yǎng)組（B組）對(duì)凋亡都有抑制作用，但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.BMSCs遷徙結(jié)果:通過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色后BMSCs細(xì)胞數(shù)量的比較，可以發(fā)現(xiàn)，IL-1β濃度的不斷升高，即隨著炎性因子對(duì)于髓核細(xì)胞損傷的程度不斷增加，BMSCs對(duì)于髓核細(xì)胞的遷徙能力不斷增強(qiáng)。四組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　5.線粒體一體化結(jié)果:從圖可以看出GFP-BMSCs可以通過(guò)隧道納

10、米管，將線粒體傳輸進(jìn)炎性損傷的NP細(xì)胞內(nèi)，完成細(xì)胞之間的直接營(yíng)養(yǎng)作用。
　　結(jié)論:BMSCs可通過(guò)旁分泌的方式，有效降低炎性所致的NP細(xì)胞退變和凋亡的比例，說(shuō)明BMSCs作為種子細(xì)胞在椎間盤(pán)退行性病變的治療中，對(duì)于椎間盤(pán)炎性環(huán)境的“治療”作用不可忽視。同時(shí)BMSCs可以炎性損傷的NP細(xì)胞進(jìn)行遷移，說(shuō)明BMSCs可以在椎間盤(pán)內(nèi)炎性內(nèi)環(huán)境嚴(yán)重的部位遷徙，發(fā)揮治療作用，以及我們觀察到在直接共培養(yǎng)的時(shí)候，BMSCs可以通過(guò)隧道納米管，向損