芍藥類(lèi)黃酮合成相關(guān)基因載體構(gòu)建及對(duì)模式植物轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、花卉植物的花色直接影響了其觀賞價(jià)值，是花卉育種的焦點(diǎn)。芍藥（Paeonia lactiflora）屬于芍藥科芍藥屬，是具有可觀的商品價(jià)值的觀賞植物，但其顏色主要集中在粉色、紅色、紫色、白色系，黃色系等品種非常稀少，這在一定程度上限制了其發(fā)展。對(duì)芍藥花色的改良創(chuàng)新一直備受關(guān)注，主要報(bào)道集中在雜交育種，利用基因工程手段進(jìn)行花色定向選育的研究受到限制，可能由于目前對(duì)芍藥花色形成的分子機(jī)理了解甚少，同時(shí)相關(guān)基因的調(diào)節(jié)機(jī)制無(wú)深刻的認(rèn)識(shí)。與花色密切

2、相關(guān)的類(lèi)黃酮合成途徑中的許多關(guān)鍵基因已在許多植物中進(jìn)行了克隆研究，因此，本研究基于課題組前期對(duì)芍藥嵌合體品種花瓣的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，在明確CHI、ANS、DFR、FLS、PAL基因均為調(diào)控芍藥類(lèi)黃酮合成途徑中調(diào)控花色的關(guān)鍵基因之后，克隆獲得目的基因，并構(gòu)建這五個(gè)基因的表達(dá)載體，以農(nóng)桿菌為介導(dǎo)轉(zhuǎn)化模式植物，以期對(duì)其功能進(jìn)行初步探索，為開(kāi)發(fā)芍藥新品種和新異花色的分子育種提供可靠的理論依據(jù)和實(shí)踐意義。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)克隆了芍

3、藥類(lèi)黃酮途徑相關(guān)基因。提取芍藥‘粉玉樓’花瓣總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，根據(jù)課題組前期對(duì)相關(guān)基因的RACE結(jié)果，克隆獲得五個(gè)目的基因CHI、ANS、DFR、FLS、PAL,均包含完整編碼區(qū)，推測(cè)氨基酸序列相似性與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分別達(dá)99％、98％、99％、100％、100％。
　　(2)構(gòu)建了芍藥類(lèi)黃酮途徑相關(guān)基因超表達(dá)載體。在擴(kuò)增獲得帶有合適的酶切位點(diǎn)的編碼區(qū)后，用SmaⅠ和SacⅠ雙酶切目的基因CHI、ANS、DFR、

4、PAL和表達(dá)載體質(zhì)粒pCAMBIA1301，用BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切目的基因FLS和表達(dá)載體質(zhì)粒pCAMBIA1301，回收、連接目的片段與載體，分別成功構(gòu)建植物超表達(dá)載體pB1301-CHI、pB1301-ANS、pB1301-DFR、pB1301-FLS、pB1301-PAL共5個(gè)。測(cè)序驗(yàn)證后，采用凍融法將重組質(zhì)粒以及空載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，獲得了用于植物轉(zhuǎn)化的材料。
　　(3)獲得純合轉(zhuǎn)CHI、ANS、DFR、FL

5、S、PAL基因擬南芥。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)Floral-dip法將目的基因CHI、ANS、DFR、FLS、PAL和空載體導(dǎo)入擬南芥，經(jīng)過(guò)T1代抗性篩選、GUS組織化學(xué)染色、T2和T3代分離比篩選，最終獲得轉(zhuǎn)CHI基因純合株系6個(gè)，轉(zhuǎn)ANS基因純合株系2個(gè)，轉(zhuǎn)DFR基因純合株系6個(gè)，轉(zhuǎn)FLS基因純合株系3個(gè)，轉(zhuǎn)PAL基因純合株系5個(gè)，以及純合的轉(zhuǎn)空載株系2個(gè)。GUS染色、PCR鑒定及qRT-PCR分析顯示，純合轉(zhuǎn)基因擬南芥均能在基因組中檢測(cè)到目

6、的基因，相對(duì)于對(duì)照組在轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)水平明顯提高。
　　(4)純合轉(zhuǎn)基因擬南芥表型初步分析。對(duì)轉(zhuǎn)基因株系的初步觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CHI、FLS及PAL基因擬南芥與對(duì)照組相比，均無(wú)顯著差異。轉(zhuǎn)DFR和ANS基因的株系，雖然花器官與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，但在抽薹期，轉(zhuǎn)ANS基因株系部分蓮座葉葉背斑塊狀發(fā)紅，主脈基部略微發(fā)紅。轉(zhuǎn)DFR基因株系蓮座葉均葉色較深，部分葉片葉背發(fā)紅，DFR表達(dá)量最高的株系2葉背為深紫紅色。對(duì)轉(zhuǎn)基因各株系總黃酮與花色苷

7、含量的測(cè)定有待進(jìn)一步研究。
　　(5)獲得轉(zhuǎn)DFR、FLS基因煙草植株。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤(pán)法將目的基因DFR、FLS和空載體導(dǎo)入煙草，通過(guò)抗性篩選，獲得轉(zhuǎn)DFR基因植株43株，轉(zhuǎn)FLS基因植株66株，轉(zhuǎn)空載對(duì)照5株。通過(guò)GUS組織化學(xué)染色、PCR鑒定，隨機(jī)挑選的10株轉(zhuǎn)DFR基因煙草中陽(yáng)性植株為8株，12株轉(zhuǎn)FLS基因煙草中陽(yáng)性植株為7株，可認(rèn)為目的基因已整合進(jìn)入煙草基因組。通過(guò)qRT-PCR對(duì)陽(yáng)性煙草中目的基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析