自然流產性別特異性胚胎淘汰及其發(fā)生機制的初步研究.pdf

1、背景與目的：
　　 自然流產是婦產科的一種常見病,其發(fā)生率約占臨床妊娠的10～0％,且近年來還呈現出逐漸上升的趨勢。在迄今為止所發(fā)現的眾多的復雜病因中,遺傳因素,尤其是染色體異常,是公認的最為常見的自然流產誘發(fā)因素。本文擬從對流產絨毛直接進行X染色體失活調查入手,研發(fā)基于STR(short tandem repeat)位點的以DHPLC(denature high performance liquidchromatography

2、,變性高效液相色譜)為技術平臺的X染色體失活診斷體系,查明自然流產中女性絨毛的X染色體失活情況,并同時結合調查母體體細胞(外周血)的X染色體失活情況,綜合分析和探討女性胚胎自然流產高發(fā)的發(fā)生機制。我們設想,由于異常的X染色體失活造成的自然流產,有三種可能:(1)母體X失活正常,但絨毛X失活異常,如母源性X染色體出現失活或父源性X染色體未完全失活,引起流產。(2)絨毛X失活正常,但母體X失活異常,且將高失活的X染色體傳遞給絨毛,引起流產。

3、(3)絨毛和母體X失活均異常,引起流產。X染色體失活正常則存在兩種可能:(1)絨毛X失活正常,母體X失活異常,但將高活性的X染色體傳遞給了絨毛；(2)絨毛和母體X失活均正常。
　　 材料與方法：
　　 1.樣品的選擇及標準:本研究選取167個早期自然流產家系,包括絨毛標本及父母雙方外周血,要求8～11孕周,B超提示胚胎停止發(fā)育,孕婦年齡為30.84±5.28(21～43歲)及116個早期人工流產家系,包括絨毛標本及母親外

4、周血,要求8～11孕周,孕婦年齡為29.60±4.47(23～48歲),排除免疫、感染、外傷等影響因素,行清宮術時予以無菌收集。
　　 2.自然流產及人工流產絨毛染色體核型分析:采用絨毛細胞培養(yǎng)法或絨毛細胞直接制備法獲取絨毛細胞染色體,進行G顯帶核型分析,用于發(fā)現自然流產最常見的誘發(fā)因素--染色體數目和結構異常,并確定胚胎性別,為下一步的研究提供分組依據。
　　 3.X染色體失活DHPLC診斷體系的建立:
　　

5、(1)特異性STR位點選擇及PCR引物設計。選用位于X染色體q11-12的雄激素受體(human androgen receptor,AR)基因第一外顯子的一個三堿基(CAG)STR位點,重復次數為8～31次,雜合度為88.8％,進行引物設計,PCR擴增,片段長度約為200～300bp。
　　 (2)所選STR位點的實際雜合度的檢測及統(tǒng)計。對422例女性標本,排除染色體核型異常后,進行基因組DNA抽提,PCR擴增,將PCR產物在

6、DHPLC非變性條件下(50℃)進行檢測,統(tǒng)計每個位點的雜合峰個數,計算實際雜合度。實際雜合度=STR位點為雜合峰的個數/總樣本個數。
　　 (3)甲基化敏感性限制性內切酶消化及內參基因的設置。用HpaII對基因組DNA進行酶切,并使用MIC2基因作為內參基因以判斷酶切效果。
　　 (4)雙重PCR/DHPLC檢測方法的建立。針對STR及MIC2基因位點建立雙重PCR體系,擴增酶切前、后的DNA標本,在DHPLC非變性條

7、件下,根據PCR產物片段長度及STR位點堿基數優(yōu)化洗脫梯度。
　　 (5)聚丙烯酰胺凝膠電泳和測序:選取2例樣本進行測序分析,選取1個家系進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,用于檢驗非變性條件下DHPLC的靈敏度。
　　 4.自然流產婦女體細胞X染色體失活與自然流產關系的研究:對165例自然流產婦女以及106例人工流產婦女,進行基因組DNA抽提,HpaⅡ消化,采用上述的雙重PCR/DHPLC進行X染色體失活檢測。結果采用失

8、活比例(d1/u1)/(d1/u1+d2/u2)(d表示消化過的峰高,u表示未消化時的峰高)進行計算,分別以失活比例>70％和失活比例>90％作為判斷SXCI的標準。
　　 5.自然流產性別特異性胚胎淘汰與X染色體失活關系的家系研究:對105個自然流產女性胚胎家系(包括絨毛與雙親外周血,其中53個絨毛為正常核型,52個絨毛為異常核型)和53個人工流產正常女性核型家系(包括絨毛與母親外周血),進行基因組DNA抽提,HpaⅡ消化,雙

9、重PCR/DHPLC進行X染色體失活檢測。絨毛SXCI判斷標準:酶切后PCR擴增產物如仍有母源的峰(失活X染色體)即為絨毛SXCI。母親SXCI判斷標準:采用失活比例>70％為失活偏移標準。
　　 結果與討論：
　　 在167例自然流產絨毛中,培養(yǎng)成功165例,成功率98.8％。檢測出染色體核型異常例數88例,異常率為53.3％(其中男性異常率60.0％,女性異常率49.5％),異常率與文獻報道相符。這一結果提示了對早期

10、自然流產絨毛進行染色體核型分析的重要性,如果能對染色體異常的流產胚胎進行明確判斷,將能對至少50％以上的早期自然流產夫婦進行病因診斷,使其免除其他無謂的檢查,并得到針對性的明確的生育指導。通過核型分析,還證實了自然流產胚胎男女比例偏移,本研究培養(yǎng)成功的165例自然流產絨毛中,男性胚胎60例,女性胚胎105例,男女性別比例為1:1.8。116例人工流產絨毛標本中,可進行核型分析的標本106例,其中男性胚胎53例,女性胚胎53例,男女比例為

11、1:1。自然流產組與人工流產組流產胚胎性別比例存在統(tǒng)計學差異(P=0.026)。
　　 使用自行設計的引物,對AR基因上的STR位點進行檢測的結果顯示,422例標本中,該位點為雜合子的標本346例,實際雜合度為82.0％,略低于文獻報道的88.8％。而MIC2基因作為內參基因有助于判斷酶切是否完全,經過抽樣測序分析和聚丙烯酰胺凝膠電泳的雙重驗證,證實所建立的雙重PCR/DHPLC的檢測效果完全符合理想,是一種相對簡單、敏感、可靠

12、與經濟的檢測技術體系,適合下一步的研究和臨床應用需要。
　　 自然流產婦女體細胞SXCI與自然流產是否存在關聯,在以往的文獻中結論不一。本研究中,165例自然流產婦女平均年齡30.84±5.28(21～43歲),106例人工流產婦女平均年齡29.60±4.47(23～48歲),兩組年齡差異無統(tǒng)計學意義(P=0.077),且兩組均為8～11孕周。檢測結果顯示,采用>70％的標準時,21.9％(30/137)的自然流產與12.8％(

13、11/86)的人工流產婦女為SXCI；采用更為嚴格的>90％標準時,8.0％(10/137)的自然流產與2.3％(2/86)的人工流產婦女為SXCI。上述兩種情況下,兩組間的SXCI發(fā)生率均無統(tǒng)計學差異(P=0.087及p=0.195),只依據婦女體細胞SXCI指標無法得到婦女SXCI與自然流產相關的結論。同時,在自然流產SXCI婦女相應的胚胎中,女性胚胎占80.0％(24/30),而非SXCI婦女中,流產女性胚胎占54.2％(58/1

14、07),兩組存在統(tǒng)計學差異(P=0.011),即婦女SXCI與胚胎特異性性別淘汰相關聯,當母親發(fā)生SXCI時,更易淘汰女性胚胎。同時,SXCI婦女的流產胚胎中三體型的比例(50.0％,15/30),高于非SXCI婦女(30.0％,32/107),P=0.040,提示婦女SXCI與三體的發(fā)生和流產之間可能存在某種聯系。
　　 在針對自然流產正常女性核型家系、自然流產異常女性核型家系以及人工流產正常女性核型家系所進行的x染色體失活檢

15、測結果顯示:53個自然流產正常女性核型家系中,40個能區(qū)分X染色體來源,而且85.0％(34/40)存在x染色體失活異常(包括28個為絨毛異常、4個為絨毛與母體均異常、2個為母體異常且傳遞給絨毛)；52個自然流產異常女性核型家系中,36個能區(qū)分x染色體來源,83.3％(30/36)存在x染色體失活異常(包括19個為絨毛異常、6個為絨毛與母體均異常、5個為母體異常且傳遞給絨毛)；而53個人工流產女性正常核型家系中,41個能區(qū)分X染色體來源

16、,而X染色體失活異常的比例僅為39.0％(16/41),而且其中15例為絨毛異常,僅1例為母體異常傳遞給絨毛。上述結果經統(tǒng)計學分析,顯示自然流產正常與異常女性核型組的X失活異常率無統(tǒng)計學差異(P>0.0125),但此二組的X失活異常率均明顯高于人工流產正常女性核型組(P值分別<0.00313),說明女性胚胎自然流產與X染色體失活異常,尤其是絨毛X染色體失活異常密切相關,而且x染色體失活有可能是獨立于染色體異常之外的一種自然流產發(fā)病因素,

17、其發(fā)生不受染色體正常與否所影響。
　　 結論：
　　 早期自然流產中存在著女性胚胎特異性淘汰現象,而X染色體失活是女性胚胎發(fā)育早期的重要事件。通過綜合比較自然流產與人工流產絨毛及流產婦女外周血x染色體失活情況,本研究發(fā)現女性胚胎自然流產與X染色體失活,尤其是絨毛x染色體失活異常密切相關,而且X染色體失活異常很可能是獨立于染色體異常之外的一種自然流產發(fā)病因素。而婦女SXCI是否與女性胚胎自然流產相關聯,取決于所下傳的X染色

18、體,將高失活X染色體傳遞給胚胎是造成女性胚胎自然流產的重要因為,也是SXCI婦女高發(fā)女性胚胎淘汰的因為所在。同時,婦女SXCI與三體的形成之間可能存在某種聯系,SXCI婦女的流產胚胎中三體型的比例顯著增高。此外,本研究所建立的X染色體失活DHPLC診斷方法具有靈敏度高、快速、簡便、經濟等特點,適合在臨床中應用于女性胚胎自然流產的病因查找,可為85％左右的女性胚胎自然流產的發(fā)生找到發(fā)病的根本因為。進一步深入探索并揭開女性胚胎發(fā)生X染色體失