一株溶血栓細菌的鑒定及其溶栓活性成分的研究.pdf

1、心腦血管疾病已成為對人類健康的最大威脅之一。近幾十年來，該病的發(fā)病率逐漸升高，對溶栓藥物的需求大增，因此研制溶栓藥具有十分重要的意義。本研究對一株來自青藏高原海拔4300 m的河流泥土的纖溶酶高產菌株DR-929進行鑒定，并對該細菌分泌的纖溶酶進行分離純化和探索其在動物體內的抗栓、溶栓效果。 (1)通過生理生化特征和16S rRNA基因序列分析對菌株DR-929進行了鑒定。生理生化試驗結果表明，菌株DR-929與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌

2、具有高度相似性，其16S rRNA基因序列分析結果顯示，菌株DR-929的16S rRNA基因序列與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌具有同源性，二者在進化分析中被聚為一類，可信度達到99％。另外，該菌并不產生溶血素，而且其普通肉湯培養(yǎng)物對小鼠也沒有毒性。 (2)菌株DR-929分泌纖溶酶的液體發(fā)酵優(yōu)化條件為：可溶性淀粉2.0％，黃豆粉1.0％，NaCl 1.0％，CaCl2 0.02％，MgSO4 0.05％，種齡36 h，發(fā)酵時間4 d，初始

3、pH8.0或8.0，溫度25℃，裝樣量30 mL，接種量5％或6％，經優(yōu)化發(fā)酵條件后活力達188.66IU/mL。 (3)經硫酸銨鹽析、疏水層析、Q FF陰離子交換層析以及G-75葡聚糖凝膠過濾層析等步驟，分離純化得到菌株DR-929分泌的纖溶酶，其在SDS-PAGE凝膠電泳膠上呈單一均勻的條帶，純化倍數(shù)為271.5倍，回收率為24.5％，活性為7003.8 IU/mg(以尿激酶為標準)。 (4)菌株DR-929分泌的纖

4、溶酶的分子量為28300 Da，最適反應溫度和最適反應pH分別為45℃和pH 8.0，其在45℃溫度下穩(wěn)定，并且在pH 5.0～8.0范圍內也比較穩(wěn)定。另外，該纖溶酶是一種金屬蛋白酶，活性能被EDTA完全抑制，而PMSF不影響其活性。該酶也屬于纖維蛋白溶解酶類，其不具有纖維蛋白溶酶原激活劑的功能。 (5)采用小鼠抗凝血模型、大鼠靜脈血栓形成模型和兔頸動脈血栓模型探索了菌株DR-929分泌的纖溶酶(FA-I)分別經口服、腸道給藥和

5、靜脈注射后在體內的藥效。結果顯示：FA—I明顯延長凝血時間(CT)、凝血酶原時間(PT)、活化的部分凝血活酶時間(APTT)和凝血酶時間(TT)(P<0.05或P<0.01)，顯著降低優(yōu)球蛋白溶解時間(ELT)和纖維蛋白原(FIG)含量(P<0.01)，并且能改善血液流變狀態(tài)。表明FA-I無論靜脈注射還是口服均能達到抗栓、溶栓效果。 綜上所述，本研究中菌株DR-929分泌的纖溶酶可能是一種新型的纖維蛋白溶解酶，其體內溶栓效果表明