丹參酮ⅡA注射液對(duì)大鼠腦缺血-再灌注損傷的防治作用.pdf

1、腦缺血/再灌注損傷(Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury，CIRI)是臨床上常見(jiàn)的病理過(guò)程，例如，發(fā)生在休克治療、心肺腦復(fù)蘇、腦血管栓塞再通和解除腦腫瘤壓迫之后等，嚴(yán)重威脅著患者的生命，對(duì)疾病轉(zhuǎn)歸有不良影響。目前，對(duì)腦缺血/再灌注損傷尚沒(méi)有確切的防治方法。 神經(jīng)元特異性烯醇酶(Neuron-Specific Enolase，NSE)是存在于大腦神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)參與糖酵解的特異酶，腦神經(jīng)

2、元損傷后，血清和腦脊液中NSE含量增加，其升高水平與腦損傷程度呈正相關(guān)，可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的一個(gè)敏感性生化指標(biāo)。 近年來(lái)，通過(guò)對(duì)丹參藥理作用的研究發(fā)現(xiàn)，丹參對(duì)腦缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用。在丹參的有效成份中，丹參酮Ⅱ A是最主要的脂溶性成份。目前關(guān)于丹參酮Ⅱ A防治腦缺血/再灌注損傷的給藥時(shí)機(jī)和給藥劑量方面的研究尚屬空白。本研究采用在缺血前和再灌注即時(shí)給予不同劑量的丹參酮Ⅱ A，觀察血中NSE的變化和腦組織形態(tài)學(xué)改變，探討

3、不同的給藥時(shí)機(jī)和給藥劑量對(duì)腦缺血/再灌注損傷的作用，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法： 一、動(dòng)物和手術(shù)：健康雄性SD大鼠56只，體重300±25g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均籠養(yǎng)，任意食水，自然采光，在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中適應(yīng)3天。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組和給藥組，給藥組設(shè)定三種給藥時(shí)機(jī)(缺血前30分鐘、再灌注即時(shí)和缺血前30分鐘+再灌注即時(shí))和四種給藥劑量(0mg/kg，3.0mg/kg，6.0mg/kg

4、，12.0mg/kg)，各實(shí)驗(yàn)條件下均采用4只大鼠進(jìn)行觀察。腦缺血/再灌注損傷模型采用改良四血管阻塞(4-VO)法。將大鼠置于麻醉盒中，放入裝有乙醚紗布的小燒杯作誘導(dǎo)麻醉，待其四肢癱軟后取出，用沾有乙醚的紗布放大鼠鼻孔附近維持麻醉．將大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，鼠頭與軀干屈曲30°，頸后正中切口1～2cm，暴露第一頸椎兩側(cè)橫突孔，將去掉針尖的61/2號(hào)針頭在酒精燈上加熱，燒灼從橫突孔中穿行的椎動(dòng)脈，使其斷開(kāi)。逢合切口。再將大鼠仰臥位固定在

5、手術(shù)臺(tái)上，頸正中切口1～2cm，頸動(dòng)脈三角處牽開(kāi)胸鎖乳突肌，分離、暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈，用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈，20min后解除動(dòng)脈夾，開(kāi)始再灌注。 模型成功標(biāo)志：去除乙醚麻醉后動(dòng)物仍意識(shí)喪失，翻正反射消失，口唇、雙眼球蒼白，角膜反射消失，瞳孔散大，金屬鑷刺激口唇無(wú)咬嚙活動(dòng)。解除夾閉后1～2 min以上癥狀均消失。出現(xiàn)抽搐及手術(shù)過(guò)程中大出血的大鼠淘汰。 二、血清NSE濃度測(cè)定：大鼠在再灌注后24h，乙醚麻醉下取心臟血

6、2ml，靜置，離心，取血清50μl，嚴(yán)格按照大鼠NSE ELISA試劑盒使用說(shuō)明操作，經(jīng)酶標(biāo)儀在450nm處讀出OD值后，在繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線上算出對(duì)應(yīng)的血清NSE濃度(μg/L)。 三、組織學(xué)觀察：將40g/L多聚甲醛(pH 7.4)固定的鼠腦自前囟-2.3mm～6.8mm范圍內(nèi)取組織做冠狀切片，脫水，包埋，HE染色，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。 四、數(shù)據(jù)分析：各組數(shù)據(jù)均以x±s表示，用Sigma Stat軟件進(jìn)行隨機(jī)效應(yīng)模

7、型的析因方差分析和Dunnett檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、不同給藥時(shí)機(jī)對(duì)大鼠血清NSE濃度的影響： 0mg/kg劑量各組之間，大鼠血清NSE濃度變化沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。3mg/kg和6mg/kg劑量各組中，再灌注即時(shí)給藥組和缺血前30分鐘+再灌注即時(shí)給藥組分別與缺血前30分鐘給藥組相比，大鼠血清NSE濃度顯著降低(p<0.05)；而再灌注即時(shí)給藥組和缺血前30分鐘+再灌注即時(shí)給藥組之間沒(méi)有顯著性差異(P

8、>0.05)。12mg/kg劑量各組之間，大鼠血清NSE濃度變化沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。 2、不同給藥劑量對(duì)大鼠血清NSE濃度的影響： 0mg/kg劑量各組和對(duì)照組相比，大鼠血清NSE濃度變化沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。3mg/kg、6mg/kg和12mg/kg劑量各組與0mg/kg劑量各組和對(duì)照組相比，大鼠血清NSE濃度顯著降低(p<0.05)。缺血前30分鐘給藥各組中，12mg/kg劑量組與3mg/kg和

9、6mg/kg劑量組相比，大鼠血清NSE濃度顯著降低(p<0.05)。再灌注即時(shí)給藥各組和缺血前30分鐘+再灌注即時(shí)給藥各組中，不同給藥劑量組間大鼠血清NSE濃度變化沒(méi)有顯著性差異(p>0.05)。 3、大鼠海馬CA1區(qū)組織學(xué)改變： 光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組和0mg/kg劑量各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹明顯，染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀或彌散性深染，核仁與染色質(zhì)分辨不清，細(xì)胞膜溶解，細(xì)胞質(zhì)外漏，細(xì)胞殘缺不全、數(shù)目減少、排列疏松，呈神經(jīng)

10、細(xì)胞損傷性改變。3mg/kg、6mg/kg和12mg/kg劑量各組大鼠海馬CA1區(qū)也可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞損傷性改變，但程度較對(duì)照組和0mg/kg組輕。 討論 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)復(fù)制大鼠全腦缺血/再灌注損傷模型，并且在缺血前30分鐘、再灌注即時(shí)和缺血前30分鐘+再灌注即時(shí)分別給予0mg/kg、3mg/kg、6mg/kg和12mg/kg的丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液，觀察給藥時(shí)機(jī)和給藥劑量對(duì)腦缺血/再灌注損傷的影響。結(jié)果顯示，在上述設(shè)定的給藥時(shí)機(jī)

11、給予不同劑量的丹參酮ⅡA，均能降低大鼠腦缺血/再灌注損傷后血清NSE濃度，且光鏡下可見(jiàn)海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷減輕，證明丹參酮ⅡA對(duì)腦缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用。而再灌注即時(shí)給藥和缺血前30分鐘+再灌注即時(shí)給藥的效果更為明顯。由于再灌注即時(shí)給藥和缺血前30分鐘+再灌注即時(shí)給藥的作用效果無(wú)顯著性差異，因此，在應(yīng)用丹參酮ⅡA保護(hù)腦組織，減少缺血/再灌注損傷時(shí)，不必聯(lián)合缺血前30分鐘給藥，在再灌注即時(shí)給藥即可。當(dāng)給予不同劑量的丹參酮ⅡA時(shí)，

12、我們發(fā)現(xiàn)，在再灌注即時(shí)給藥或缺血前30分鐘+再灌注即時(shí)給藥時(shí)，低劑量與高劑量的作用效果相近。因此為減少藥物副作用，在應(yīng)用丹參酮IIA保護(hù)腦組織，減少缺血/再灌注損傷時(shí)，給予低劑量藥物即可達(dá)到保護(hù)作用。 結(jié)論： 1、丹參酮ⅡA對(duì)腦缺血/再灌注損傷具有保護(hù)作用。 2、在腦缺血/再灌注即時(shí)給予丹參酮ⅡA，對(duì)腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用優(yōu)于腦缺血之前給藥。 3、在腦缺血/再灌注即時(shí)給予丹參酮ⅡA時(shí)，低劑量與高劑量