五個與棉纖維發(fā)育相關(guān)基因的克隆與鑒定.pdf

1、棉纖維是重要的紡織工業(yè)原料，在國民經(jīng)濟和人民生活中占有重要的位置。棉纖維是由棉花胚珠外珠被表皮層的單細胞發(fā)育而成，在受精后約16天，棉纖維細胞可延伸至2.5-3.0cm。棉纖維發(fā)育過程中合成大量的纖維素與非纖維素多糖參與纖維形態(tài)的建成，這一發(fā)育過程有眾多的糖類物質(zhì)參與，進行了復(fù)雜的生化代謝反應(yīng)，因此棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因的克隆既具有巨大的潛在經(jīng)濟價值，也有助于植物細胞發(fā)育以及纖維素合成分子機理的闡明。 本研究從優(yōu)質(zhì)材料7235不同

2、發(fā)育時期的棉纖維混合cDNA文庫中分離出五個cDNA克隆：(1)陸地棉纖維表達蛋白(cotton fiber expressed protein，GhCFE)(GenBank登錄號：DQ073045)，該cDNA克隆插入片段長度為1274bp，開放讀碼框長度為996bp，編碼331個氨基酸，Blastx結(jié)果表明，該cDNA序列與已報道的3個陸地棉纖維表達蛋白cDNA克隆相似性均很高，與CFEl，CFE2和CFE3分別達到了95％，98％

3、和96％；(2)2，5-二羥苯乙酸1，2-加雙氧酶(homogentisate1.2-dioxygenase，HGD)，該cDNA克隆插入片段長度為1697bp，開放讀碼框長度為1422bp，編碼473個氨基酸，Blastx結(jié)果表明，該cDNA序列與已報道的番茄(Lvcopersicon esculentum)的2，5-二羥苯乙酸1，2-加雙氧酶(homogentisate1.2-dioxygenase)的相似性為84％，與擬南芥(Ar

4、abidopsis thaliana)的2，5-二羥苯乙酸1，2-加雙氧酶(homogentisate 1,2-dioxygenase)(At5g54080)相似性為81％；(3)兩個過氧化物酶(peroxidase，POD)，其中一個是利用5’RACE技術(shù)得到的長度為1489bp的完整cDNA序列，開放讀碼框長度為816bp，編碼271個氨基酸，Blastx結(jié)果表明，該基因最大的ORF編碼的氨基酸和擬南芥中一個過氧化物酶基因的氨基酸相

5、似性為70％，我們將其命名為GhPODl；另一個cDNA克隆插入片段長度為1355bp，開放讀碼框長度為999bp，編碼332個氨基酸，Blastx結(jié)果表明，該cDNA序列與已報道的陸地棉纖維過氧化物酶基因(pod8，L08199)相似性很高，達到了99％，并且氨基酸比較也基本相似，將其命名為GhPOD2；(4)果膠裂解酶(pectate lyase，PL)，該cDNA克隆插入片段長度為1539bp，開放讀碼框長度為1236bp，編碼4

6、11個氨基酸，Blastx比較結(jié)果顯示，我們克隆的這個cDNA序列與蘋果(Malus x domestica)的一個果膠裂解酶相似性最高，達到85％，與辣椒(Capsicum annuum)、草莓(Fragariax ananassa)、百日菊(Zinnia elegans)、葡萄(Vtis vinifera)等物種的果膠裂解酶也都有一定的相似性。因此，我們將這個基因命名為GhPL，它在棉花中是首次報道(GenBank登錄號：DQ073

7、046)。 我們采用SignalP程序?qū)@五個基因進行了N端信號肽預(yù)測，除了GhHGD沒有典型的信號肽，其余四個基因都有典型的信號肽，說明這四個基因可能是分泌蛋白。并且對這五個基因進行了保守區(qū)域及進化樹分析等。 從表達特征來看，GhCFE在根、莖中都不表達，在葉中微弱表達，在胚珠和纖維細胞中表達，并在開花后5～20天的纖維中持續(xù)高效表達，20天后減弱，是一個棉纖維優(yōu)勢表達基因；GhHGD在根、莖、葉、胚珠和纖維細胞中都

8、表達，但是在葉、開花后1天和3天的胚珠中表達較弱，在開花后5天的纖維中表達增強，在17天的纖維中表達又減弱，所以該基因是一個在開花后5天到14天的纖維中優(yōu)勢表達的基因；GhHGD在根中不表達，在莖、葉、胚珠和纖維細胞中表達，并在開花后14天的纖維中表達開始逐漸減弱；GhPL在根、莖、葉中都不表達，在纖維和胚珠中表達，是一個棉纖維特異表達基因；GhHGDl是組成性表達的基因。 soutllem雜交結(jié)果表明這五個基因在陸地棉基因組中

9、都存在兩個拷貝，其中A，D亞組中各有一個拷貝。 我們GhCFED，GhPL構(gòu)建了pBll21-35s啟動子正義載體及E6啟動子正義和反義載體，對GhPOD2構(gòu)建了pBll21-35s啟動子正義和反義載體，并對GhPL構(gòu)建了RNAl載體，現(xiàn)在正在進行棉花轉(zhuǎn)基因功能驗證。 將GhHFE，GhHGD和GhPL入酵母表達載體pREP5N，通過電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化酵母細胞，結(jié)果表明GhHGD的導(dǎo)入使酵母細胞在長度及長/寬上有顯著差異，G