牛乳鐵蛋白肽（bLF pep）的基因改造、克隆和融合表達.pdf

1、目的：獲得bLF pep的基因序列，依據bLF peP的結構特征及相關的文獻報道，尋找合適的突變位點，并將bLF pep與突變體(M1和M2)分別在大腸桿菌中克隆和融合表達，初步測定它們的抗菌活性。 方法：根據bLF pep的氨基酸序列，應用大腸桿菌偏愛密碼子，設計bLF pep的基因序列。并對bLF Pep基因進行改造，將bLF pep基因序列中第10位Met密碼子ATG用Trp密碼子TGG來代替，得到突變體M1的基因序列；將

2、bLFpep基因序列中第7、10位的Gin、Met密碼子CAG、ATG分別用Thr、Cys密碼子ACC、TGC來代替，得到突變體M2的基因序列。分別設計、合成兩個DNA片段，通過連接反應得到兩端有EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位點的二拷貝基因同向串聯(lián)體。將bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝串聯(lián)體分別與克隆載體pUC18連接、轉化大腸桿菌DH5α，經藍白篩選，挑取陽性菌落，抽提重組質粒，酶切、PCR鑒定并測序。測

3、序正確后將bLF PeP、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝串聯(lián)體分別和表達載體pGEX-4T-1連接，轉化大腸桿菌BL21，挑取菌落，抽提重組質粒，酶切、PCR鑒定并測序。將鑒定為陽性的菌落用IPTG 37℃誘導表達4小時，SDS-PAGE電泳觀察表達結果。抽提全菌體蛋白，用B-PER GST SpinPurification kit純化得到融合蛋白，然后用凝血酶和羥胺切割融合蛋白。最后用抑菌圈實驗初步鑒定bLF pep、

4、bLF pep突變體M1和突變體M2蛋白的抗真菌活性。 結果： 1、獲得了bLF PeP、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝串聯(lián)體。 2、分別將bLF PeP、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝串聯(lián)體克隆到載體pUC18上，初步檢測、篩選陽性轉化子，并測序，結果表明與預先設計的bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2基因序列一致，突變體M1和M2達到預期突變效果，同時二拷貝基因

5、重組質粒構建成功。 3、構建了融合表達載體pGEX-4T-1與bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝串聯(lián)體重組質粒，初步檢測、篩選陽性轉化子，進一步測序正確，可以進行誘導表達。 4、二拷貝基因串聯(lián)體插入表達載體pGEX-4T-1后，經IPTG誘導表達4h，SDS-PAGE電泳結果可見約29KD的融合蛋白條帶，說明二拷貝基因串聯(lián)體得到融合表達。 5、表達的融合蛋白經純化，然后用凝血酶和羥胺

6、對融合蛋白切割初步得到bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2蛋白。通過抑菌圈實驗，可以看到bLF pep和突變體M2蛋白表現出了對白色念珠菌ATCC64550的抑制活性。 結論：成功獲得了bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2基因二拷貝同向串聯(lián)體；并構建了bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2二拷貝基因重組質粒；bLF pep、bLF pep突變體M1和突變體M2二拷貝基因的融合表達獲得