肝細胞核因子4誘導肝細胞功能的體外和體內研究.pdf

1、目的：首先比較不同肝細胞、胚胎干細胞(embryonic stem cell，ES)以及肝腫瘤細胞．HNF4α基因和肝細胞相關功能基因的表達情況，然后選擇HNF4α作為外源目的基因，利用AdEasy<'TM>系統(tǒng)構建表達HNF4α的重組復制缺陷型腺病毒AdHNF4α，通過病毒體外感染人肝腫瘤細胞株(HepG2和Hep3B)以及小鼠ES細胞，上調目的基因在細胞內表達，分別觀察HNF4α基因上調對其生物學功能的影響；并應用HNF4α基因修飾

2、HepG2細胞治療急性肝功能衰竭小鼠，初步觀察小鼠生存率和肝功能改善情況。 實驗方法： 一、比較不同肝細胞、肝腫瘤細胞以及ES細胞HNF4α和肝細胞相關功能基因的表達RT-PCR檢測人正常成熟肝細胞、人肝腫瘤細胞株以及人胎肝細胞株HNF4α基因和肝細胞相關功能基因的表達；同法檢測小鼠正常成熟肝細胞、不同發(fā)育階段胎肝細胞、小鼠ES細胞HNF4α基因和肝細胞相關功能基因的表達。 二、重組復制缺陷型腺病毒AdHNF4α

3、構建及鑒定將pAdTrack-CMV與獲得的HNF4α cDNA片段均經BglⅡ、EcoRⅤ酶切后連接，獲得質粒pAdTrack-CMV-HNF4α，將Pme Ⅰ酶切線性化的pAdTrack-CMV-HNF4α與pAdEasy-1質粒共轉化BJ5183感受態(tài)細菌同源重組，PacⅠ酶切篩選出pAdHNF4α，并測序驗證目的基因序列的正確性。PacⅠ酶切線性化的pAdHNF4α轉染293細胞，反復感染、凍融293細胞，獲得AdHNF4α，以

4、同樣方法獲得對照病毒AdGFP。將AdHNF4α體外感染胎肝細胞株L02，以RT-PCR和Western blot檢測HNF4α在肝細胞中的表達。 三、外源導入HNF4α對人肝腫瘤細胞生物學特性影響人肝腫瘤細胞株HepG2和Hep3B均以5×10<'5>/皿接種于六孔板，分別將病毒以感染復數(multiplicity of infection，MOI)40、50感染細胞，24 h后更換含10％胎牛血清的新鮮DMEM培液，3 d后

5、觀察GFP表達，RT-PCR和Western blot檢測HNF4α表達，RT-PCR檢測肝細胞相關功能基因的表達，流式細胞儀測定肝腫瘤細胞凋亡率。 四、外源導入HNF4α對小鼠ES細胞生物學特性影響首先制備小鼠原代胚胎成纖維細胞(primary mouse embryonic fibroblast，PMEF)滋養(yǎng)層，將小鼠ES細胞接種于其上進行培養(yǎng)和傳代；將ES細胞以密度為2x10<'5>/ml接種于培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)，第5 d

6、將形成的胚體以30～40個/皿接種于0.1％明膠包被過的35 mm組織培養(yǎng)皿使其貼壁誘導分化，培養(yǎng)液中分別加入AdHNF4α或對照病毒AdGFP，在分化過程中觀察GFP，并添加病毒維持HNF4α表達，免疫細胞化學法檢測CK8、CK18、AFP以及ALB的表達，RT-PCR檢測肝細胞相關功能基因的表達，過碘酸-Schiff氏法(Periodic Acid-Shift，PAS)法檢測糖原合成，吲哚氰綠(Indocyanine Green，I

7、CG)吸收染色實驗檢測細胞代謝ICG功能。 五、HNF4α基因修飾的移植肝細胞治療小鼠急性肝功能衰竭將HNF4α基因修飾的HepG2(HepG2-HNF4α)以4×10<'6>/只通過尾靜脈導入CCl<,4>誘導的急性肝功能衰竭小鼠體內，通過檢測小鼠血清總膽紅素和血糖，觀察小鼠的一般情況和生存率等指標，評估HNF4α基因修飾的HepG2對實驗性急性肝功能衰竭的治療效果。 六、統(tǒng)計學處理數據采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件包進

8、行分析，灰度比值采用One-Way ANOVA分析，方差非齊性則采用非參數檢驗；P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01為具有非常顯著性差異。 實驗結果： 一、在不同分化水平的肝細胞中HNF4α表達有明顯差異。 1.RT-PCR檢測人正常成熟肝細胞、人肝腫瘤細胞株Huh-7、Hep3B、HepG2、人胎肝細胞株L02以及WRL-68的HNF4α基因和肝細胞相關功能基因的表達情況，結果顯示在不同分化水平的肝細胞中

9、HNF4α表達有明顯差異，在正常成熟的肝細胞中表達最高，其表達量約為肝腫瘤細胞株Huh-7表達量的4倍、Hep3B表達量的10倍以及HepG2表達量的2.3倍(P<0.05)，而在永生化的胚胎肝細胞株L02和WRL-68中無明顯表達；同時肝細胞的重要功能基因如載脂蛋白CⅢ(apolipoprotein cⅢ，APOCⅢ)、葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G-6-P)、白蛋白(albumin，ALB)、谷胺

10、酰氨合成酶(glutaminesynthetase，GS)、細胞色素P450家族1α2(cytochrome P450 1α2，CYP1α2)、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)以及甲狀腺激素結合蛋白(transthyretin，TTR)的表達與HNF4α基因的表達密切相關，這些基因在成熟肝細胞中的表達較肝腫瘤細胞株明顯增多，而胚胎肝細胞株中未見明顯表達。 2.

11、RT-PCR比較小鼠正常成熟肝細胞、ES細胞、胚齡13 d胎肝細胞、胚齡15 d胎肝細胞、胚齡19 d胎肝細胞和出生后1 d小鼠胎肝細胞的HNF4α以及肝細胞相關功能基因的表達情況，結果顯示：隨著分化水平的提高，HNF4α表達逐漸增加，同時肝細胞相關的重要功能基因如CYP1α2、ALB、G-6-P、苯丙氨酸羥化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)、PEPCK、TTR以及GS等表達也相應逐漸上調。 二、

12、AdHNF4α的構建及鑒定。通過PCR擴增獲得1425 bp人HNF4α cDNA片段，測序鑒定并作同源序列分析加以證實；體外連接獲得穿梭質粒pAdTrack-CMV-HNF4α，同源重組后篩選獲得pAdHNF4α；經293細胞包裝并反復感染、凍融，獲得1×10<'10>表達形成單位/ml(efu/ml)滴度的AdHNF4α；AdHNF4α體外感染肝細胞株L02 3 d后，RT-PCR和Western blot檢測HNF4α在轉錄和翻譯

13、水平上的表達均明顯增強，證實病毒構建成功并能在細胞內維持HNF4α高效表達。 三、外源導入HNF4α基因對人肝腫瘤細胞生物學特性的影響。 1.將AdHNF4α以MOI 40、50分別感染細胞HepG2和Hep3B 3 d后，熒光顯微鏡下可見90％以上的細胞表達GFP；RT-PCR與Western blot均檢測出HNF4α在腫瘤細胞中表達明顯上調。 2.RT-PCR顯示，導入HNF4α基因明顯提高肝腫瘤細胞CYP

14、1 α 2、G-6-P、GS、PEPCK以及APOCⅢ等肝細胞相關功能基因mRNA表達，其中G-6-PmRNA表達上調近50倍，而ALB、TTR表達未見明顯變化，AFP表達則明顯下調。 3.流式細胞儀結果表明：上調肝腫瘤細胞HNF4α表達后細胞的凋亡率分別增加約3.0倍(Hep3B中AdGFP組凋亡率10.1％，AdHNF4α組29.8％，P<0.05)和4.5倍(HepG2中AdGFP組凋亡率6.5％，AdHNF4α組29.2

15、％，P<0.05)。 四、外源導入HNF4α對小鼠ES細胞生物學特性影響。 1.將小鼠ES細胞株ES-D3復蘇后接種于鋪有MEF滋養(yǎng)層細胞的組織培養(yǎng)皿中，每天換液，2～3 d可見到表面光滑、邊界清楚的細胞克隆，懸浮培養(yǎng)形成胚體。 2.將第5 d的胚體接種于0.1％明膠包被過的組織培養(yǎng)皿，使其貼壁誘導分化，并在培養(yǎng)液中加入AdHNF4α感染3 d后，熒光顯微鏡下可見克隆周邊分化的細胞90％以上均表達GFP； RT-

16、PCR與免疫細胞化學法均檢測出HNF4α在小鼠ES細胞的表達較對照組明顯上調，HNF4α蛋白主要表達于細胞核內。 3.免疫細胞化學法顯示，AdHNF4α感染實驗組細胞早在第8 d即有CK8、CK18以及AFP大量表達，且較對照組(陰性對照組和AdGFP感染組)明顯增強；感染組細胞ALB于第15 d開始表達，較對照組顯著增加。 結論： 1.HNF4α表達與肝細胞分化水平明顯相關。隨著分化水平的提高，其表達逐漸增加，

17、在正常成熟的肝細胞中表達最高，同時肝細胞生物學功能基因表達水平與HNF4α的表達密切相關。 2.利用AdEasy<'TM>腺病毒載體可將外源HNF4α基因導入肝腫瘤細胞并維持高效表達，并增強正常肝細胞重要功能基因表達，腫瘤細胞生物學特性明顯改善。 3．通過上調小鼠ES細胞HNF4α表達，可明顯提高正常肝細胞如CYP1α2、G-6-P、PAH以及ALB等功能基因的表達，糖原合成和ICG代謝功能顯著增強，ES細胞向肝細胞定向分化的能