NRG-1參與大鼠自體神經移植再生的機制研究.pdf

1、雖然顯微外科技術已經有了很大的進步和發(fā)展，但是對于周圍神經損傷和再生的病理生理機制我們仍然缺乏深入了解。周圍神經缺損的治療仍然是外科醫(yī)生的一個重大難題。準確的掌握神經損傷修復的解剖學、病理生理學和外科重建技術是對神經損傷修復治療的先決條件。對于大于5cm的神經缺失，直接的神經吻和會導致過大的張力，導致治療的失敗，需要進行自體神經移植或者應用套管技術。對于套管技術，雖然在生物醫(yī)學工程方面取得了很大的創(chuàng)新和突破，但是由于免疫耐受的因素，仍然

2、無法有效的應用于臨床治療。自體神經移植依然是治療神經損傷的金標準，但是移植后修復的過程慢，壞死率高，是移植中常常遇到的問題。近年來，許多研究者發(fā)現NRG-1參與了神經損傷的修復，并且發(fā)揮著重要調節(jié)的作用。本研究中，為了探索NRG-1在神經移植后修復過程中的調節(jié)作用，我們采用SD大鼠自體神經移植模型，首先觀察了NRG-1的表達變化及移植神經的修復過程，然后通過反義寡核苷酸技術，抑制NRG-1在自體神經移植模型中的表達，并采用SB20358

3、0特異性抑制P38α MAPK激活，并分別觀察神經移植后髓鞘修復及神經功能恢復的過程，進一步分析NRG-1參與調控神經移植后髓鞘修復的作用及其信號轉導機制。實驗分為三部分：
　　實驗一、NRG-1在大鼠自體神經移植再生過程中的變化
　　目的：
　　研究NRG-1在大鼠自體坐骨神經移植再生過程中的變化
　　方法：
　　采用清潔級健康雄性SD大鼠，40只，體重250-300g隨機分為實驗組和對照組，每組20只，

4、按手術后3、7、14、21、28天分為5個時間點。實驗組行坐骨神經倒轉自體移植術，對照組單純暴露坐骨神經后縫合處理，在不同時間點觀察大鼠足跡的變化，計算坐骨神經指數（SFI），電生理檢測運動神經傳導速度（MNCV）變化，之后分別切取實驗組移植段坐骨神經和對照組移植對應段的坐骨神經，透射電鏡觀察移植后的神經端髓鞘再生的變化，并通過RT-PCR技術檢測II型和III型NRG-1 mRNA的表達變化，Western blot技術檢測NRG-1

5、蛋白表達變化。
　　結果：
　　術后各個時間點的實驗組坐骨神經指數均低于對照組，且實驗組坐骨神經指數隨時間進行逐漸增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；在自體神經移植的3-28天實驗組的坐骨神經運動神經傳導速度小于對照組，并且有統(tǒng)計學差異（P均<0.01）；實驗組有髓鞘神經纖維的面積（um2）在第7、14、21、28天與對照組比較有明顯的統(tǒng)計學差異（P<0.01），實驗組軸突直徑在第7、14、21天與對照組比較有明顯的統(tǒng)計

6、學差異（P<0.01）；RT-PCR結果分析顯示，在移植的3-28天II型NRG-1 mRNA表達均較對照組增高，且差異有統(tǒng)計學意義（P分別<0.01）；Western blot結果顯示在神經移植術后第3-28天，II型NRG-1和III型NRG-1蛋白表達也明顯增高，且有顯著性差異（P分別<0.01）。
　　結論：
　　在神經移植后，NRG-1 mRNA及蛋白表達上調，II型NRG-1和III型NRG-1表達改變不同。NR

7、G-1可能參與了神經移植后髓鞘再生的調節(jié)過程。
　　實驗二、II型NRG-1在大鼠自體神經移植再生過程中的作用
　　目的：
　　研究II型NRG-1在大鼠自體坐骨神經移植再生過程中可能的作用。
　　方法：
　　采用清潔級健康雄性SD大鼠，54只，體重250-300g隨機分為空白組（Blank）、緩沖液對照組（Model）和反義寡核苷酸抑制組（ASON），每組18只，按手術后3、7、14、21、28、35天分

8、為6個時間點。緩沖液對照組和反義寡核苷酸抑制組行自體坐骨神經倒轉移植術，在術后當日和第三天，Model組給予手術切口局部注射PBS緩沖液，ASON組給予注射II型NRG-1反義寡核苷酸；空白組單純暴露坐骨神經后縫合處理。在不同時間點觀察大鼠足跡的變化，計算坐骨神經指數，電生理檢測運動神經傳導速度。之后分別切取Model組及ASON組移植段坐骨神經和Blank組移植對應段的坐骨神經，透射電鏡觀察移植后的神經端髓鞘再生的變化，RT-PCR技

9、術檢測 II型NRG-1 mRNA的變化，以及通過Western blot技術檢測II型NRG-1蛋白變化，分析II型NRG-1在自體神經移植中可能的作用。
　　結果：
　　發(fā)現術后ASON組除第3天以外，其余各個時間點的ASON組坐骨神經指數均低于Model組的結果且差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），在移植的14-35天，抑制II型NRG-1的表達，可減慢大鼠坐骨神經傳導速度。說明缺少II型NRG-1減緩自體移植神經的再生

10、。髓鞘的形態(tài)學分析提示II型NRG-1在自體神經移植3-28天，對髓鞘的崩解，雪旺細胞髓鞘化的過程中均發(fā)揮著一定的調節(jié)作用。RT-PCR和Western blot顯示：II型NRG-1的mRNA和蛋白的表達均較Model組明顯減低。
　　結論：
　　II型NRG-1在SD大鼠自體神經后神經再生的的過程中，在移植的3-28天，對髓鞘的崩解，雪旺細胞髓鞘化的過程中均發(fā)揮著一定的調節(jié)作用。缺少II型NRG-1可能影響移植后神經功能

11、的恢復。
　　實驗三、P38-MAPK參與NRG-1調控大鼠自體神經移植再生過程的機制研究
　　目的：
　　P38MAPK在大鼠自體神經移植再生過程中對NRG-1/ErbB信號系統(tǒng)的轉導作用。
　　方法：
　　采用清潔級健康雄性SD大鼠，54只，體重250-300g隨機分為空白組（Blank）、緩沖液對照組（Model）和P38α MAPK抑制組（P38α MAPK），每組18只，按手術后3、7、14、21

12、、28、35天分為6個時間點。Model組和P38α MAPK抑制組行自體坐骨神經倒轉移植術，在術后當日和第三天，Model組給予移植切口局部注射PBS緩沖液，P38α MAPK抑制組給予注射P38α MAPK抑制劑SB2035802；空白組單純暴露坐骨神經后縫合不對其其他實驗處理。在不同時間點觀察大鼠足跡的變化，計算SFI，電生理檢測MNCV，透射電鏡觀察移植后的神經端髓鞘再生的變化，RT-PCR技術檢測髓鞘堿性蛋白（MBP）mRNA

13、的變化，以及通過Western blot技術檢測P-P38α MAPK蛋白變化。
　　結果：
　　SD大鼠的SFI值在移植的7、14、21、28、35五個時間點，P38α MAPK抑制組坐骨神經指數均低于Model組。MNCV值顯示：在自體神經移植的14、21、28、35天P38α MAPK抑制組的傳導速度小于Model組。在電鏡的髓鞘觀察和分析中有髓鞘神經纖維的面積（um2）：P38α MAPK抑制組在第28、35天出現與

14、Model組明顯的統(tǒng)計學差異（P<0.01），而前期無明顯統(tǒng)計學差異；單位面積的有髓鞘神經纖維的數量：P38α MAPK抑制組與Model組無明顯的統(tǒng)計學差異；軸突的直徑：在第21、28、35天出現P38α MAPK抑制組與Model組明顯的統(tǒng)計學差異（P<0.01）；對于G-ratio，在第28天和35天P38α MAPK抑制組均較Model組高且有明顯的統(tǒng)計學差異（P<0.01）。Western blot和RT-PCR顯示：大鼠切口

15、局部注射SB203580后，MBP的mRNA：P38αMAPK抑制組的表達較Model組減少；P-P38α MAPK：P38α MAPK抑制組均較Model組少。
　　結論：
　　在SD大鼠自體神經移植后，抑制P38α MAPK的激活，會出現大鼠神經功能恢復減慢，有髓鞘神經纖維的面積和軸突的直徑會減小，G-ratio值增加。提示在自體神經移植模型中，P38α MAPK可能為NRG-1/ErbB信號轉導途徑的下游信號，并對神經