胞膜窖-窖蛋白在小鼠牙發(fā)育過程中作用的初步研究.pdf

1、二十世紀(jì)九十年代以來，隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)以及遺傳學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科的迅猛發(fā)展以及干細(xì)胞和組織工程技術(shù)在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床中的應(yīng)用，再生醫(yī)學(xué)已初步顯示出良好的發(fā)展前景，使得牙齒再生逐步成為可能，這引起了越來越多的學(xué)者對(duì)這一領(lǐng)域的關(guān)注。目前牙再生研究中的熱點(diǎn)主要集中在牙發(fā)育的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控上。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是胞膜窖/窖蛋白(caveolae/caveolin-1)最重要的生理功能之一。caveolae是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的平臺(tái)，使各信號(hào)

2、通路的串話成為可能，caveolin-1處于該平臺(tái)中各個(gè)信號(hào)通路的中心位置。發(fā)育生物學(xué)研究證實(shí)，在顱神經(jīng)嵴細(xì)胞分化形成牙頜骨器官的過程中，先后經(jīng)歷了顱神經(jīng)嵴到第一鰓弓外胚間充質(zhì)再到牙頜骨外胚間充質(zhì)兩次關(guān)鍵性級(jí)聯(lián)分化。本課題旨在建立小鼠第一鰓弓外胚間充質(zhì)細(xì)胞及下頜第一磨牙牙胚間充質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行誘導(dǎo)分化研究，鑒定其細(xì)胞生物學(xué)特性。同時(shí)，采用分子生物學(xué)等技術(shù)手段，為揭示caveolae/caveolin-1在牙發(fā)育過程中

3、的分子調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。本研究共分以下幾個(gè)部分： 一.外胚間充質(zhì)細(xì)胞和牙胚間充質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型的建立。解剖分離E9.5小鼠第一鰓弓及E16.5小鼠下頜第一磨牙牙胚，采用改良酶消化法對(duì)其進(jìn)行原代培養(yǎng)，利用反復(fù)貼壁和多次差異消化法對(duì)其進(jìn)行純化，通過細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞生長曲線描記、計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間和特異性標(biāo)記物檢測對(duì)其細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行研究。在此基礎(chǔ)上，取第5代細(xì)胞，更換不同的條件培養(yǎng)液，觀察其在礦化誘導(dǎo)液的刺激下，細(xì)胞形態(tài)學(xué)變

4、化，并檢測鑒定相應(yīng)的特異性細(xì)胞表型標(biāo)記，對(duì)細(xì)胞的可塑性進(jìn)行研究。 二．小鼠牙發(fā)育過程中caveolae/caveolin-1表達(dá)的初步研究。在間充質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型建立的基礎(chǔ)上，采用透射電子顯微鏡和流式細(xì)胞儀的方法觀察外胚間充質(zhì)細(xì)胞和牙胚間充質(zhì)細(xì)胞的生長周期中caveolae的超微形態(tài)變化，通過免疫組化和RT-PCR觀察caveolin-1在外胚間充質(zhì)細(xì)胞牙向分化過程中的表達(dá)情況，了解兩者之間可能存在的相互關(guān)系。 三．構(gòu)

5、建小鼠caveolin-1基因重組腺病毒載體。應(yīng)用AdEasy重組腺病毒載體系統(tǒng)，以細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒間同源重組的方法構(gòu)建攜帶小鼠caveolin-1編碼區(qū)基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體pAd-caveolin-1，并在293細(xì)胞中擴(kuò)增制備該重組腺病毒?？捎糜赾aveolin-1基因功能的研究，亦可應(yīng)用于在牙組織工程中對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行基因修飾和改造，模擬caveolin-1在體內(nèi)牙胚發(fā)育過程中的時(shí)空特異性表達(dá)。 四．caveolin-1過

6、表達(dá)促進(jìn)cyclinD1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖。通過pAd-caveolin-1轉(zhuǎn)染外胚間充質(zhì)細(xì)胞及牙胚間充質(zhì)細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期蛋白的改變，RT-PCR檢測細(xì)胞周期蛋白cyclin D1基因的表達(dá)，以明確caveolin-1是否參與了cyclinD1細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。 研究結(jié)果表明E9.5胎鼠第一鰓弓界限清楚明確，便于準(zhǔn)確取材，采用改良酶消化法原代培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)間約2～3天，上皮細(xì)胞成分較少，可以在短時(shí)間內(nèi)獲得數(shù)量充足、

7、純度較高的滿足實(shí)驗(yàn)要求的細(xì)胞。特異性標(biāo)記物CD57免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈均一表達(dá)。對(duì)外胚間充質(zhì)細(xì)胞及牙胚間充質(zhì)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測、電鏡觀察、免疫細(xì)胞染色及RT-PCR檢測顯示，這兩種細(xì)胞在增殖、caveolae的形態(tài)及基因的表達(dá)等方面均有差異，這提示caveolae和caveolin-1可能與細(xì)胞的增殖和成熟有關(guān)，通過小鼠caveolin-1基因重組腺病毒載體過表達(dá)caveolin-1，顯示轉(zhuǎn)染前外胚間充質(zhì)細(xì)胞中cyclin D1的表達(dá)高

8、于牙胚間充質(zhì)細(xì)胞eyclin D1的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后兩種細(xì)胞中cyclin D1的表達(dá)都有明顯的下降，表明caveolin-1參與了cyclin D1介導(dǎo)的細(xì)胞增殖信號(hào)通路的調(diào)控。綜上所述，本研究建立了E9.5外胚間充質(zhì)細(xì)胞和E16.5牙胚間充質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，所培養(yǎng)外胚間充質(zhì)細(xì)胞及牙胚間充質(zhì)細(xì)胞具有高度的增殖活性和自我更新能力，具有多向分化潛能。通過構(gòu)建小鼠的caveolin-1腺病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染外胚間充質(zhì)細(xì)胞和牙胚間充質(zhì)細(xì)胞，采用R