CIK細胞對淋巴瘤荷瘤鼠移植模型抗腫瘤作用及其機制的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 過繼性細胞免疫治療(Adoptive cellular immu-notherapy,ACI)是指向腫瘤患者轉輸具有抗腫瘤活性的免疫細胞(特異性的和非特異性的),以直接殺傷腫瘤或激發(fā)機體免疫反應殺傷腫瘤細胞,從而達到治療腫瘤目的的一種生物治療方法。近年來,由于綜合治療的合理應用,相當一部分的非霍奇金淋巴瘤可以治愈或緩解,但患者由于長期化療導致全身情況較差,且出現干細胞受損,外周血管損傷,患者耐受性差,需尋求新的治療

2、手段。目前,細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cells,CIK)過繼免疫治療已進入臨床試驗,國內外諸多報道顯示其對多種惡性腫瘤均有一定的療效,是一種很有潛力的免疫細胞治療方法。CIK細胞是一種增殖速度快,殺瘤活性高,殺瘤譜廣的高效免疫活性細胞,并且對正常造血影響輕微,對于促進患者免疫系統(tǒng)的重建、消除殘留病變及骨髓凈化都具有良好效果。迄今為止,CIK細胞對淋巴瘤細胞株作用的基礎研究及在淋巴瘤的臨床應

3、用的報道較多,但在淋巴瘤荷瘤鼠體內研究尚少。本試驗通過檢測應用CIK處理前后Burkitt淋巴瘤荷瘤鼠移植瘤細胞的細胞周期及凋亡的變化,CIK處理前后荷瘤鼠瘤體大小的變化、荷瘤鼠瘤組織bcl-2、Ki-67蛋白表達的差異,研究觀察CIK細胞對淋巴瘤荷瘤鼠的抑制作用,并探討其作用機制,為CIK細胞進一步應用于臨床提供理論依據。
　　 方法:
　　 1腫瘤細胞的傳代培養(yǎng):將Burkitt淋巴瘤Raji細胞加入含10％FBS的

4、1640培養(yǎng)基懸浮,置于37℃、5％CO2,飽和濕度條件下傳代培養(yǎng),取對數生長期的細胞用于實驗。
　　 2 CIK細胞的制備及體外擴增:取正常人的外周肝素抗凝血,經淋巴細胞分層液密度梯度離心分離外周血單個核細胞(Peripheral bloodMononuclear cell,PBMC),依據不同時間分別加入γ-干擾素(IFN-γ)、抗CD3單克隆抗體(Anti-CD3Mcab)、白細胞介素-2(rhIL-2)等細胞因子,體外誘

5、導成CIK細胞。以上培養(yǎng)細胞常規(guī)培養(yǎng)、傳代。三天換液時取少量細胞懸液使用血細胞計數板計數并制作增殖曲線。
　　 3 MTT法測定CIK細胞對Raji細胞的殺傷作用:將CIK細胞與Raji細胞以不同效靶比(E:T分別為10:1、20:1、40:1),加入96孔板,每組3復孔,常規(guī)設相應空白對照,培養(yǎng)24、48小時后,四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法測定分光光度值(OD),計算殺傷活性。
　　 4建立荷瘤裸鼠模型并分組:在Ba

6、lb/c-nu/nu裸小鼠腋下接種Burkitt淋巴瘤Raji細胞1×107ml,0.2ml/只,建立淋巴瘤裸鼠模型。每3天定時用游標卡尺測量移植瘤大小,記錄長徑和短徑,按公式(體積=長徑×短徑2/2)計算腫瘤體積大小并繪制腫瘤生長曲線。裸鼠成瘤后,將荷瘤鼠隨機分為A、B、C3組(每組各5只):A為生理鹽水對照組,B、C均為CIK細胞治療組,分別在瘤旁注射體外培養(yǎng)14天的CIK細胞,注射量分別為2×107/0.2ml/只,4×107/0

7、.2ml/只,每組均隔日一次,共三次。
　　 5殺鼠取瘤并進行相應項目的檢測:第7天裸鼠頸椎脫臼處死,剝離腫瘤塊并稱重,用游標卡尺測量腫瘤的大小,并計算腫瘤的體積,計算腫瘤生長抑制率。機械法處理腫瘤制成單細胞懸液,流式細胞術測定細胞凋亡率,并測定bcl-2、Ki-67蛋白的表達水平。
　　 結果:
　　 1 CIK細胞對Raji細胞有明顯殺傷作用,不同效靶比(10:1,20:1,40:1)的CIK細胞與Raji細

8、胞共同作用不同時間(24h,48h)后,OD值均有不同程度減少,且隨著CIK細胞濃度的增加、作用時間的延長,OD值逐漸減小,而CIK細胞對Raji細胞的殺傷作用隨之增加,作用時間為24h時CIK細胞對Raji細胞殺傷活性分別為(15.7±1.4)％、(33.8±2.3)％、(49.2±2.1)％；作用時間為48h時殺傷活性分別為(27.9±1.7)％、(59.3±2.0)％、(78.3±1.6)％。相同作用時間不同效靶比之間差異有統(tǒng)計學

9、意義(P<0.05),同一效靶比不同作用時間之間差異也有統(tǒng)計學(P<0.05)。
　　 2與生理鹽水對照組相比,CIK細胞治療組荷瘤鼠瘤體均較前縮小,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),B組抑瘤率為(23.7±0.56)％,C組抑瘤率為(54.3±0.68)％,試驗組(B、C)與對照組(A)相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),試驗組(B、C)組間比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 3荷瘤鼠移植瘤細胞經不同密

10、度的CIK細胞(0、2×107/0.2ml、4×107/0.2ml)作用后,G0/G1期細胞比例隨CIK細胞數目的增加逐漸增加(所占百分比分別為28.56±1.69、34.41±0.34、53.43±1.87),同時S期及G2/M期細胞比例逐漸減少,S期所占比例分別為(52.66±4.60)％、(49.62±1.22)％、(34.87±0.67)％,G2/M期所占比例分別為(17.87±0.49)％、(15.43±0.44)％、(11.

11、97±1.23)％,由此得出移植瘤細胞的增殖指數(PI)也隨之逐漸降低,A、B、C各組PI分別為(72.18±3.32)％、(64.40±1.31)％、(46.91±0.69)％,試驗組(B、C)移植瘤細胞各期所占比例及PI分別與對照組(A)相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),試驗組(B、C)組間比較差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 4移植瘤細胞經不同密度的CIK細胞(0,2×107/0.2ml,4×107/0.2

12、ml)作用后,FCM檢測移植瘤細胞凋亡,結果顯示對照組未見明顯的凋亡峰,試驗組(B、C)經流式細胞儀測得典型的亞二倍體凋亡峰,隨CIK細胞密度的增加,凋亡峰值增加,細胞凋亡率增高,凋亡率分別為(6.19±1.16)％、(13.17±0.17)％,與對照組(0.94±0.87)％相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 5經過不同密度CIK細胞作用后,由FCM測得移植瘤細胞bcl-2蛋白熒光指數(FI)分別為A:1.00±0.01

13、、B:0.96±0.01、C:0.87±0.02。Ki-67蛋白熒光指數(FI)分別為A:1.00±0.01、B:0.95±0.01、C:0.83±0.02,由此可見移植瘤細胞bcl-2蛋白及Ki-67蛋白表達均較對照組下降,二者與對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；CIK細胞治療組間比較亦有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。
　　 結論:
　　 1 CIK細胞對Burkitt淋巴瘤Raji細胞有殺傷活性；且此殺傷活性與

14、CIK細胞數量、共培養(yǎng)時間呈正相關,有明顯的劑量-效應和時間-效應依賴關系；
　　 2體內抗腫瘤實驗結果證實正常人CIK細胞可有效抑制Burkitt淋巴瘤荷瘤鼠移植模型瘤體的生長；
　　 3 CIK細胞能夠影響淋巴瘤移植瘤細胞周期分布,引起G0/G1期阻滯,從而阻止瘤細胞進入分裂相,使增殖減慢,并且CIK細胞還可以直接誘導腫瘤細胞凋亡;
　　 4 CIK細胞在體內對Raji細胞的抑制作用與抑制bcl-2、Ki-6