壓力性尿失禁患者基因表達譜及相關基因多態(tài)性研究.pdf

1、研究背景: 國際尿控協(xié)會(international continence society，SCI)明確規(guī)定，在腹壓增加時出現(xiàn)不自主的尿道內尿失禁稱為壓力性尿失禁(SUI)。女性壓力性尿失禁的發(fā)病率在40％左右，國際尿控協(xié)會將這一常見的中、老年人病視為一種國際性疾病加以研究。并認為其構成了社會和衛(wèi)生問題，與盆腔器官脫垂(POP)共同被稱為盆底功能障礙性疾病(PFD)。壓力性尿失禁的病因和發(fā)病機制很復雜，有多因素參與，不單純是解剖學理論，

2、已經演變到功能性和解剖學并重的理論。生物體只有當它們受到一定因素影響，行使特定功能時，相關的基因才會表達。因此基因表達能揭示很多生物學過程。對環(huán)境、遺傳或者生化信號發(fā)生反應時，基因表達會被激活或抑制數(shù)倍甚至數(shù)千倍，形成了特征性的基因表達圖譜，稱為某一生理/病理現(xiàn)象的“分子圖像”，可以用于了解基因的功能和調控途徑之間的相互關系，有助于對生物體發(fā)生的生理生化過程的認識。隨著90年代中期微陣列芯片技術的應用，特別是人類基因組計劃的完成，可以利

3、用基因表達譜芯片得到組織標本的“分子圖像”，然后對不同病理生理條件下得到的“圖像”進行平行表達比較，從而在更深的水平認識器官的生理或病理現(xiàn)象。 研究目的: 應用基因表達譜芯片研究SUI中的基因表達情況，篩選在SUI和正常對照之間差異表達的基因，并對相關的差異基因進行驗證；通過比較絕經前后壓力性尿失禁婦女差異表達基因mRNA和蛋白質水平表達，進而分析女性激素對SUI發(fā)病相關基因表達的調節(jié)機制，探討SUI發(fā)生發(fā)展的分子機制。通過差異

4、基因多態(tài)性與SUI易感相關性的研究，循征SUI發(fā)病的遺傳學因素。 研究方法: 1.在絕經狀態(tài)、年齡、體重指數(shù)、產次、盆腔手術史等影響SUI發(fā)生的重要因素匹配的前提下，選取3例絕經后SUI與3例絕經后無SUI對照的尿道旁陰道組織標本。提取總RNA，并對總RNA進行定量、質檢。采用RNA擴增標記法合成生物素標記的cRNA，與Human Genome U133 Plus 2.0芯片雜交。 2.用SAM軟件篩選｜Scor

5、e(d)｜≥2，F(xiàn)C值大于2或小于0.5的差異表達基因。用MAS2.0軟件對差異表達基因進行基因功能分類注釋(GO)和代謝通路分析(Pathway)。 3.實時熒光定量PCR、免疫組化技術、Western Blot技術檢測絕經后SUI組和絕經后正常對照組差異表達基因mRNA水平和蛋白水平的表達，從而驗證芯片的準確性，以進一步分析差異表達基因的功能。 4.實時熒光定量PCR、免疫組化技術、Western Blot技術檢測絕

6、經后SUI組和絕經前SUI組差異表達基因mRNA水平和蛋白水平的表達，分析女性激素對SUI發(fā)病相關基因表達的影響。 5.聚合酶鏈反應—限制性片段長度多態(tài)性法(PCR—RFLP)分析差異基因多態(tài)性與SUI易感的相關性。 研究結果: 1.提取總RNA經定量和電泳檢測，質量滿足芯片雜交要求。雜交后芯片的各項檢測參數(shù)均達到質控要求，尿道旁陰道壁組織與基因表達譜芯片的雜交模型建立成功。 2.篩選出75個在SUI組和

7、對照組之間差異表達的基因。其中包括3個功能未知的基因。31個基因在SUI組中表達上調，44個基因在SUI組中表達下調。差異基因涉及多種功能蛋白和代謝通路。其中SNARE神經遞質傳遞通路、神經變性通路的相關基因變化最顯著，包括GOSR1、ApoE、GRB2、GBA基因。 3.絕經后SUI組GOSR1、ApoE、GRB2、GBA在mRNA水平和蛋白水平的表達差異與芯片結果一致。 4.絕經后SUI組較絕經前SUI組的ApoE、

8、GRB2蛋白表達上調，而GOSR1、GBA蛋白表達下調，差異無統(tǒng)計學意義。 5.SUI組和對照組ApoE等位基因頻率經H．W．平衡定律檢驗，具有群體代表性。ApoE的3種等位基因頻率及6種基因型在SUI組和對照組分布無統(tǒng)計學差異，SUI人群危險性等位基因e4的頻率高于對照組；保護性等位基因e3的頻率低于對照組。 結論: 1.人類全基因組表達譜芯片是一種有效的高通量篩選SUI差異表達基因的研究方法。本實驗以｜Sco

9、re(d)｜≥2，F(xiàn)C≥2或FC≤0.5為標準篩選出75個在SUI組和對照組之間差異表達的基因。其中包括3個功能未知的基因。31個基因在SUI組中表達上調，44個基因在SUI組中表達下調。 2.SUI的病理生理過程復雜，涉及多種功能蛋白和代謝通路。其中神經變性通路的基因表達產物所導致的神經損傷和退行性變與SUI的發(fā)生發(fā)展密切相關。 3.實時定量熒光PCR、Western Blot驗證目標差異基因GOSR1、APOE、GR