人肝再生增強因子結合肽的篩選、表達及功能研究.pdf

1、目的：人肝再生增強因子(human augmenter of liver regeneration，hALR)是肝臟再生過程中的一個重要調控因子，在肝損傷修復過程中發(fā)揮重要作用，但有關它在肝再生過程中的分子生物學機制尚未完全明確。本研究擬從人QGY肝癌細胞cDNA文庫中篩選出可能與hALR發(fā)生相互作用的蛋白質，并對之進行鑒定、克隆和生物學功能的初步研究，將有助于闡明hALR的信號傳導機制，進而為闡明肝臟損傷與再生的分子生物學機制提供理論

2、基礎。 方法： 1．hALR結合肽的篩選以hALR為靶蛋白，從人肝癌細胞cDNA噬菌體展示文庫中篩選與hALR相互作用的特異噬菌體克??；對獲得的特異噬菌體克隆進行PCR及ELISA鑒定，并對獲得的cDNA插入片段進行測序和生物信息學分析；利用<'3>H-TdR摻入法測定hALR聯(lián)合陽性噬菌體克隆對QGY肝癌細胞株的增殖效應。 2．用RNA干擾技術研究hALR與citron kinase的相互關系采用細胞免疫化學、

3、共聚焦顯微鏡及RT-PCR方法檢測QGY細胞胞中citron kinase的表達情況及與hALR的關系；設計并合成了三條針對citron kinase不同靶位的siRNA片段，用脂質體轉染法瞬時轉染細胞后48h，分別用real-time RT-PCR法檢測citron kinase的mRNA水平變化，western blot法檢測citron kinase蛋白水平的變化以及用細胞免疫化學、共聚焦顯微鏡觀察QGY細胞中citron kin

4、ase表達變化的情況；利用<'3>H-TdR摻入法檢測RNA干擾48h后，hALR刺激QGY細胞的增殖情況。 3．GST-hALRIP融合蛋白的構建、表達及功能研究用PCR法從與hALR具有相互作用的特異噬菌體cDNA克隆中擴增出hALR相互作用肽(hALRIP)的DNA片段，并將其亞克隆入質粒pGEX-4T-2中；重組質粒pGEX-4T-2-hALRIP被轉化入宿主菌BL21(DE3)中，在IPTG誘導下進行表達；表達產(chǎn)物GS

5、T-hALRIP融合蛋白采用Glutathione Sepharose 4B親合層析法純化；用pull-down實驗驗證GST-hALRIP融合蛋白與hALR在體外的相互作用；采用<'3>H-TdR摻入法檢測GST-hALRIP融合蛋白對hALR刺激QGY細胞增殖活性的影響。 結果： 1．hALR結合肽的篩選 (1)人肝癌細胞cDNA噬菌體表面展示文庫經(jīng)過四輪篩選后，噬菌體的富集效果(即噬菌體的產(chǎn)率)從2.9×1

6、0<'3>上升到了9.0×10<'-1>，表明特異性結合噬菌體得到了明顯富集。 (2)通過ELISA方法檢測所篩選到的陽性噬菌體克隆在不同稀釋度時與包被在酶標板上的hALR的結合性，結果顯示，在包被了hALR的孔中，A495nm吸光值隨著噬菌體數(shù)量的增加而增加，說明所篩選到的陽性噬菌體克隆與hALR的結合是特異的，且呈劑量依賴關系。 (3)對四輪篩選后得到的噬菌體克隆進行PCR擴增，均擴增出約300bp的cDNA插入片段

7、，測序結果顯示序列完全一致，表明通過四輪篩選后與hALR有相近親和力的特異性噬菌體得到大量富集。 (4)將所獲得的hALR相互作用肽(hALRIP)序列信息在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫中進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)與人citron kinase mRNA部分序列同源性達100％。根據(jù)跨膜蛋白預測分析軟件分析，hALRIP序列位于citron kinase開放閱讀框架(ORF)N端第1846～2057位堿基之間，即598～668氨基酸位置，不

8、在citron kinase的跨膜區(qū)位置。 (5)將不同滴度四篩后噬菌體液與hALR混合后同時作用于QGY細胞，觀察到顯著促增殖效應，且明顯高于單獨的hALR組(F=29.28，p<0.01)；而混合hALR的不同滴度的對照噬菌體組與單獨的hALR組間比較無顯著性差異(F=0.638，p>0.05)，提示篩庫獲得的陽性噬菌體展示肽與hALR之間有協(xié)同效應。 2．用RNA干擾技術研究hALR與citron kinase的相

9、互關系 (1)RT-PCR結果顯示人肝癌細胞QGY中有citron kinase表達；細胞免疫化學、共聚焦顯微鏡觀察顯示citron kinase主要分布在QGY細胞的胞漿和胞核中，在細胞分裂期則位于分裂溝及中間體位置；并且QGY細胞經(jīng)hALR刺激后，citron kinase的表達量明顯增加，說明hALR能促進QGY細胞中citron kinase的表達，兩者之間存在著相關性。 (2)成功構建和合成了三條針對citro

10、n kinase基因上不同靶位點的siRNA片段，其中靶序列1和2是針對hALRIP序列，并成功轉染QGY細胞；real-time RT-PCR結果顯示轉染48h后三條siRNA片段均能有效抑制citron kinase基因的表達，mRNA的表達水平分別只相當于抑制前的37.89％、22.69％和26.61％，再一次證明hALRIP片段為citronkinase上的一段；western blot和激光共聚焦顯微鏡結果顯示三條siRNA均

11、能有效抑制citron kinase蛋白的表達，與抑制citron kinase的mRNA表達程度相符，表明siRNA抑制mRNA水平和抑制蛋白表達的程度顯著相關。 (3)<'3>H-TdR摻入法測定轉染siRNA片段48h后，hALR刺激QGY細胞增殖的cpm值分別為4639±382、3060±201和3576±425，與轉染陰性對照組(7007±156)和空白組(7566±1009)相比，有顯著性差異(p<0.05)，其中

12、siRNA2抑制作用最明顯，但三組間無顯著性差異，表明hALR刺激QGY細胞增殖是通過citron kinase發(fā)揮作用的，citron kinase是hALR的下游因子，只要阻斷citron kinase的表達就能阻斷hALR的促增殖作用。 3．GST-hALRIP融合蛋白的構建、表達及功能研究 (1)成功構建了hALRIP的重組質粒pGEX-4T-2-hALRIP，并經(jīng)酶切、PCR和測序鑒定完全正確。 (2)

13、重組質粒pGEX-4T-2-hALRIP在宿主菌BL21(DE3)中得到高效表達，GST-hALRIP融合蛋白分子量約為33 kd，與預計理論值相符合；表達的目的蛋白主要存在于包涵體內(nèi)，部分存在于細菌破碎上清中；通過Glutathione Sepharose 4B親合純化得到的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定為單一條帶，蛋白定量為103.2μg/ml。 (3)pull-down實驗結果顯示GST-hALRIP融合蛋白與hALR蛋白

14、之間有結合作用，而GST與hALR蛋白之間沒有結合作用，表明hALRIP蛋白與hALR之間在體外存在有相互結合作用。 (4)<'3>H-TdR摻入法檢測GST-hALRIP融合蛋白對hALR刺激QGY細胞增殖活性的影響結果顯示，GST-hALRIP融合蛋白和空載體表達的融合蛋白在高濃度時均能顯著抑制hALR的促Q(mào)GY細胞增殖效應(p<0.05)，并且兩者之間無差異(p>0.05)，結果未能反映出GST-hALRIP融合蛋白與hA

15、LR結合的特異性。 結論： 1．從人肝癌細胞cDNA噬菌體表面展示文庫中成功篩選出hALR結合肽hALRIP。 2．證實hALRIP片段為citron kinase上的一段。 3．QGY細胞中有citron kinase的表達，hALR能促進citron kinase的表達。 4．成功構建和合成citron kinase的siRNA片段，并能有效抑制QGY細胞中citron kinase基因的表達