食管鱗癌中FBXO32基因的表達及其甲基化狀態(tài)研究.pdf

1、目的:消化道惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康，我國是世界食管癌的高發(fā)國，尤其是河北的磁縣和涉縣是世界食管癌的高發(fā)區(qū)之一。食管癌因其癥狀的隱匿性極難早期發(fā)現(xiàn)，癥狀明顯時已是腫瘤的中晚期，因此預后較差。近年來對食管癌的病因已進行廣泛研究，其中對表觀遺傳學的改變尤其是DNA啟動子區(qū)甲基化的研究已經(jīng)成為熱點。
　　 DNA甲基化是真核細胞DNA最普遍的修飾形式，同時是哺乳類動物的一種復制后調(diào)節(jié)方式，DNA甲基化與基因表達呈負相關。許多國內(nèi)外

2、的研究顯示基因啟動子異常甲基化在許多腫瘤的發(fā)生過程中是一個頻發(fā)的早期事件，因此腫瘤相關基因的甲基化狀態(tài)是腫瘤發(fā)生的一個早期敏感指標，被認為是有前景的腫瘤分子標志物。本研究通過檢測食管癌細胞和食管鱗癌組織中肌肉萎縮相關基因1(FBXO32，又名atrogin-1，MAFbx)基因的mRNA和蛋白表達情況以及甲基化狀態(tài)，探討FBXO32基因在食管鱗癌中的表達及臨床意義。
　　 方法:
　　 1應用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(rev

3、ersetranscriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR)技術分別檢測應用DNA去甲基化劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-2’-deoxycitydine，5-aza-dC）處理前后的食管癌細胞系(TE1、TE13、T.TN、Yes-2)和51例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中FBXO32基因的mRNA表達情況。
　　 2應用免疫細胞/組織化學（immunocytochemical/imm

4、unohistochemistry）SP法分別檢測應用5-aza-dC處理前后的食管癌細胞系和51例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中FBXO32蛋白的表達情況。
　　 3應用甲基化特異性PCR(methylationspecificpolymerasechainreaction，MSP)技術分別檢測應用5-aza-dC處理前后的食管癌細胞系和51例食管鱗癌組織及癌旁正常組織中FBXO32基因的甲基化狀態(tài)。
　　 4運用統(tǒng)計軟

5、件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　 結(jié)果:
　　 1食管癌細胞中FBXO32基因的表達及甲基化狀態(tài)情況
　　 1.15-aza-dC處理前后的食管癌細胞系中FBXO32的mRNA表達情況
　　 四株未處理的食管癌細胞株中，TE1細胞株中FBXO32基因mRNA表達陽性，TE13、T.TN、Yes-2細胞株中該基因mRNA表達缺失，經(jīng)5-aza-dC處理培養(yǎng)后，四種細胞株中均檢測出FBXO32m

6、RNA的表達。
　　 1.25-aza-dC處理前后的食管癌細胞中FBXO32基因蛋白表達情況
　　 TE1細胞株用5-aza-dC處理前蛋白表達陽性，TE13、T.TN、Yes-2細胞株5-aza-dC處理前FBXO32蛋白表達陰性，應用甲基化抑制劑5-aza-dC處理后四種食管癌細胞株中FBXO32的蛋白表達均呈陽性，表明應用5-aza-dC處理后FBXO32在食管癌細胞系中恢復表達。
　　 1.35-aza

7、-dC處理前后食管癌細胞系中FBXO32的甲基化狀態(tài)
　　 TE13、T.TN、Yes-2細胞株在5-aza-dC處理前表現(xiàn)為FBXO32基因高甲基化狀態(tài)，應用甲基化抑制劑5-aza-dC處理后該三種細胞株中FBXO32基因均表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)。TE1細胞株在5-aza-dC處理前表現(xiàn)為不完全甲基化狀態(tài)，應用甲基化抑制劑5-aza-dC處理后表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)。
　　 2食管癌組織中FBXO32基因的表達、甲基化狀態(tài)及其

8、與臨床病理資料之間的關系
　　 2.1食管癌組織中FBXO32基因mRNA表達情況
　　 FBXO32基因mRNA在食管癌和癌旁正常組織中的表達量分別為0.24±0.15和0.49±0.21，食管癌組織中FBXO32基因的mRNA表達量明顯低于癌旁正常組織，兩者的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。在食管鱗癌患者中，F(xiàn)BXO32的mRNA表達與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及腫瘤組織分期和分化程度有關(P＜0.05)。
　　

9、 2.2食管癌組織中FBXO32基因蛋白表達情況
　　 51例食管鱗癌組織中，其中12例FBXO32基因蛋白表達陽性，陽性表達率為23.5％;正常食管黏膜組織51例，其中36例FBXO32基因蛋白表達陽性，陽性表達率為70.5％，正常食管黏膜組織FBXO32蛋白陽性表達率顯著高于食管癌組織(P＜0.01)。在食管鱗癌中，F(xiàn)BXO32蛋白表達與患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(P＜0.05)，而與腫瘤組織的分期和分化程度無關（P＞0.05

10、）。
　　 2.3食管癌組織中FBXO32基因甲基化狀態(tài)
　　 FBXO32基因啟動子區(qū)在食管鱗癌組織和癌旁正常組織中的甲基化率分別為52.9％(27/51)和27.5％(14/51)，食管鱗癌組織中FBXO32基因啟動子區(qū)甲基化率顯著高于癌旁正常組織(P=0.000)。低分化鱗癌組FBXO32基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率84.0％(21/25)顯著高于高中分化鱗癌組甲基化發(fā)生率23.1％(6/26)(P＜0.05);FBX

11、O32基因啟動子區(qū)在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的甲基化發(fā)生率80.8％(21/26)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的甲基化發(fā)生率24.0％(6/25)(P＜0.05);FBXO32基因啟動子區(qū)甲基化率與腫瘤組織分期、年齡和性別無關(P＞0.05)。
　　 2.4FBXO32基因甲基化與其mRNA和蛋白表達的關系以及mRNA和蛋白表達之間的關系
　　 FBXO32蛋白表達陽性的食管鱗癌組織中，其mRNA相對表達量平均為0.33±0.19，F(xiàn)B

12、XO32蛋白表達陰性的食管鱗癌組織中，其mRNA相對表達量平均為0.21±0.13，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在FBXO32基因啟動子區(qū)甲基化陽性的食管鱗癌組織中，其mRNA相對表達量平均為0.19±0.12，甲基化陰性的食管鱗癌組織中mRNA相對表達量平均為0.30±0.17，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。發(fā)生FBXO32基因啟動子區(qū)高甲基化的食管鱗癌組織中FBXO32蛋白表達陽性率為11.1％(3/27)，未發(fā)生

13、FBXO32基因啟動子區(qū)高甲基化的食管鱗癌組織中FBXO32蛋白表達陽性率為37.5％(9/24)，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1FBXO32基因啟動子區(qū)異常甲基化是其在食管癌細胞中表達缺失的重要機制之一，5-aza-dC能逆轉(zhuǎn)FBXO32基因的甲基化，恢復FBXO32的表達，為FBXO32作為食管癌去甲基化治療的靶標提供了科學依據(jù)。
　　 2FBXO32啟動子區(qū)甲基化情況與患者年