心臟瓣膜間質細胞凋亡與鈣化的相關性研究.pdf

1、背景:
　　 心臟瓣膜鈣化性病變是常見的心臟瓣膜病理性改變之一。心臟瓣膜發(fā)生嚴重鈣化后對心臟血流動力學、心臟瓣膜功能、患者的生活質量和預后均產生產生巨大影響。目前，多數研究提示在瓣膜間質細胞發(fā)生鈣化的演變過程中，瓣膜間質細胞出現了不同程度的細胞凋亡，鑒于細胞凋亡是多基因調控的主動過程，其中caspase-3是凋亡的主要調控基因，因此細胞凋亡可能影響并參與了瓣膜間質細胞鈣化過程。根據基因預測網站發(fā)現凋亡敏感標志物caspase-3

2、與mir-30b在3'UTR端存在結合位點，同時國內學者已經通過基因芯片檢測正常心臟組織與其他人體內臟器證實，mir-30b表達含量在心臟組織中最高，提示caspase-3可能受到mir-30b的調控繼而影響心臟的生理、病理變化。
　　 目的:
　　 1.通過體內、體外實驗明確瓣膜間質細胞凋亡與鈣化的相關性并確定caspase-3在瓣膜間質細胞凋亡調控中的作用;
　　 2.分析mir-30b與細胞凋亡的相關性，并

3、通過體外過表達和抑制實驗明確mir-30b對細胞生存功能的影響。
　　 方法:
　　 1.瓣膜間質細胞凋亡在鈣化性心臟瓣膜病瓣膜中的表達
　　 通過常規(guī)組織學染色、免疫組織化學染色、TUNEL、Von Kossa染色、流式細胞術對瓣膜組織上的細胞凋亡情況進行分析。通過體外分離鑒定瓣膜間質細胞，應用流式細胞術、Von Kossa染色、Western blot對細胞學上凋亡情況進行驗證。
　　 2.瓣膜間質細

4、胞凋亡調控機制的初步探討
　　 通過PCR檢測瓣膜組織中mir-30b的表達含量，與瓣膜組織中凋亡情況作出相關性分析。心臟瓣膜間質細胞轉染mir-30b mimics或inhibitors后，在體外，使用Annexin V-FITC/PI對瓣膜間質細胞雙染后通過流式細胞檢測術檢測細胞凋亡情況，通過caspase-3活性檢測進一步確定mir-30b對瓣膜間質細胞凋亡能力的影響，通過CCK-8檢測mir-30b對瓣膜間質細胞株增殖能

5、力的影響。Western blot檢測調控mir-30b后細胞水平上凋亡相關基因caspase-3的表達。
　　 結果:
　　 1.瓣膜間質細胞凋亡在鈣化性心臟瓣膜病瓣膜中的表達
　　 常規(guī)組織學病理分析顯示鈣化是鈣化性心臟瓣膜病瓣膜的主要病變，并伴隨紅色膠原纖維含量增高而藍色的彈力纖維斷裂、含量降低。通過TUNEL1技術檢測，鈣化性瓣膜中細胞凋亡率顯著高于無鈣化瓣膜，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。免疫組織

6、化學檢測鈣化性瓣膜中凋亡關鍵基因caspase-3陽性率顯著高于無鈣化瓣膜，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。體外實驗證實caspase-3是多基因調控的主動過程，是凋亡的主要調控基因。
　　 2.瓣膜間質細胞凋亡調控機制的初步探討
　　 通過real-time PCR檢測，mir-30b在鈣化性瓣膜中的表達下降，在無鈣化瓣膜組織中的表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。Mir-30b相對表達量與瓣膜組織細胞凋

7、亡率呈負相關，下調mir-30b的表達可顯著增加瓣膜間質細胞的凋亡，下調mir-30b的表達可顯著抑制瓣膜間質細胞的增殖能力，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。mir-30b的目標靶基因為凋亡關鍵基因caspase-3，下調mir-30b的表達可導致caspase-3表達顯著增高(P＜0.01)。
　　 結論:
　　 1.在組織學與細胞學上，鈣化性心臟瓣膜病瓣膜的鈣化程度與瓣膜間質細胞凋亡率增加具有相關性。