雙價(jià)抗蟲基因楊的獲得、抗蟲鑒定及安全性評價(jià).pdf

1、楊樹屬楊柳科(Salicacea)楊屬(Populus)，是世界上分布最廣、適應(yīng)性最強(qiáng)的樹種，對保持生態(tài)平衡起著重要的作用，它不僅是世界上最重要的紙漿原料，還是優(yōu)良的再生能源的原料。但楊樹蟲害發(fā)生嚴(yán)重，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)損失。利用基因工程培育抗蟲品種是提高楊樹抗蟲性的有效途徑。我國是世界上第一個(gè)商業(yè)化種植轉(zhuǎn)基因抗蟲楊的國家，所采用的基因?yàn)樘K云金芽孢桿菌內(nèi)毒素基因（Bt基因），但單一基因易引起害蟲抗性的產(chǎn)生，同時(shí)轉(zhuǎn)入兩個(gè)或兩個(gè)以上

2、抗蟲基因能有效延緩害蟲抗性的產(chǎn)生，同時(shí)提高轉(zhuǎn)基因品種的抗蟲性，擴(kuò)大其擴(kuò)蟲譜。本研究發(fā)明了不需通過植物組織培養(yǎng)的“原位葉芽基因轉(zhuǎn)化法”，并采用該方法將源于東亞鉗蝎的昆蟲特異性毒素(BmkIT)基因與源于煙草天蛾的幾丁質(zhì)酶(chitinase)基因構(gòu)建的雙價(jià)基因?qū)霔顦?，并分析了該雙價(jià)基因的抗蟲效果，探討了其抗蟲楓理，進(jìn)而以食草動物兔子為動物材料，研究了轉(zhuǎn)chitinase-BmkIT楊樹葉作為青飼料的安全性問題。獲得的主要結(jié)果如下:

3、>　　一、原位葉芽轉(zhuǎn)化雙價(jià)基因
　　以青楊(Populus cathayana Rehd)品種中林美荷為供試植物材料，連續(xù)三年采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的原位葉芽轉(zhuǎn)化法對雙價(jià)基因chitinase-BmkIT進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，該方法能夠?qū)⑼庠椿蜣D(zhuǎn)入楊樹中，頂芽的轉(zhuǎn)化率高于側(cè)芽。雖然該方法會產(chǎn)生嵌合體，通過連續(xù)兩年用標(biāo)記抗生素卡那霉素篩選及PCR擴(kuò)增檢測，淘汰了嵌合體，分別得到1％(2006年)和2.24％(2007年)的轉(zhuǎn)化率，South

4、ern雜交表明，雙價(jià)基因確已整合到楊樹基因組中，整合方式既有單拷貝也有多拷貝。將轉(zhuǎn)化枝扦插繁殖后，分子檢測證明外源基因可以通過無性繁殖方式遺傳。
　　二、轉(zhuǎn)雙價(jià)基因楊的抗蟲性鑒定
　　分別以蛀桿害蟲光肩星天牛幼蟲和食葉害蟲美國白蛾幼蟲為供試蟲源，進(jìn)行了抗蟲研究。通過對一齡光肩星天牛取食轉(zhuǎn)基因楊樹莖干30天后與對照比較，表明轉(zhuǎn)chitinase-BmkIT基因楊對天牛生長基本無抑制作用，表現(xiàn)在取食轉(zhuǎn)基因楊莖桿的天牛與取食非轉(zhuǎn)化

5、對照的天牛體重和體長均無顯著差異(p＞0.05)，且觀察表明，兩組天牛所蛀隧洞大小也無明顯差異。
　　轉(zhuǎn)chitinase-BmkIT基因楊對美國白蛾有一定的抑制作用，表現(xiàn)在取食轉(zhuǎn)基因葉片不僅對美國白蛾當(dāng)代的生長發(fā)育產(chǎn)生了抑制和致死作用，且對其后代的繁衍造成了抑制。研究結(jié)果表明，取食轉(zhuǎn)基因株系楊樹葉片使美國白蛾的死亡率顯著提高，且對美國白蛾幼蟲身長和體重的抑制顯著高于取食非轉(zhuǎn)化株系(p＜0.05)，而且，取食轉(zhuǎn)基因葉片使部分美國白

6、蛾幼蟲不能化蛹，即使化蛹，卻不能羽化或羽化不正常，未能交配即死亡，因而可以有效降低美國白蛾的危害。
　　三、轉(zhuǎn)雙價(jià)基因楊的抗蟲機(jī)理探討
　　為探討雙價(jià)基因chitinase-BmkIT的抗蟲機(jī)理，以轉(zhuǎn)雙價(jià)基因(chitinase-BmkIT)楊樹葉片飼喂美國白蛾幼蟲，采用石蠟切片法，對美國白蛾幼蟲中腸結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，并對其頭部乙酰膽堿酯酶活性進(jìn)行測定。結(jié)果表明:取食轉(zhuǎn)基因楊樹葉片的美國白蛾幼蟲中腸結(jié)構(gòu)不完整，中腸細(xì)胞出現(xiàn)排列不

7、整齊、脫落等現(xiàn)象。本試驗(yàn)中，取食未轉(zhuǎn)化葉片的美國白蛾幼蟲頭部乙酰膽堿酯酶活性顯著高于對照處理，極有可能是BmkIT基因表達(dá)的結(jié)果。興奮型昆蟲特異性神經(jīng)毒素BmkIT可能會通過抑制乙酰膽堿酯酶活性，造成昆蟲過度興奮而死亡或生長受抑。幾丁質(zhì)酶通過水解幾丁質(zhì)發(fā)揮作用，中腸切片表明，取食轉(zhuǎn)化葉片的幼蟲中腸結(jié)構(gòu)不完整，有細(xì)胞脫落、斷裂現(xiàn)象，表明外源幾丁質(zhì)酶在昆蟲體內(nèi)仍有活性，并通過對圍食膜的破壞造成昆蟲易感病、拒食、身體潰爛等現(xiàn)象。切片觀察與乙酰

8、膽堿酯酶活性測定為證實(shí)此雙價(jià)基因的抗蟲效應(yīng)和闡明此雙價(jià)基因的抗蟲機(jī)理提供了證據(jù)。
　　四、轉(zhuǎn)雙價(jià)基因楊對兔子的安全評價(jià)
　　為明確轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲基因（chitinase-BmkIT）楊作為飼料的安全性，本研究以食草動物兔子為材料，通過連續(xù)70天飼喂一定量的轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諚顦湫迈r葉片，比較了飼喂前后血常規(guī)及血生化部分指標(biāo);記錄了取食轉(zhuǎn)基因葉片及非轉(zhuǎn)化葉對兔子生長的影響;對處理組和對照組兔子解剖后觀察并稱重，分析了兩組的臟器比

9、;石蠟切片比較了處理組和對照組兔子的組織形態(tài)結(jié)構(gòu);檢測了外源基因在兔子組織中的整合情況。結(jié)果表明:取食轉(zhuǎn)基因楊樹葉與非轉(zhuǎn)化葉兔子的生長無顯著差異;處理組兔的肝臟重于對照組，但兩組兔子的肝組織形態(tài)均正常，且無差異，其它臟器如腎、脾、胃、小腸、心臟、肺均無病理變化;試驗(yàn)結(jié)束后，兩組兔子的生化及血常規(guī)指標(biāo)均無顯著差異;源于轉(zhuǎn)基因楊樹葉的chitinase，BmkIT, kanamycin均未在兔子的小腸、血液及肌肉中檢出。以上結(jié)果初步說明，轉(zhuǎn)