Ⅰ、Ⅲ型膠原，雙糖鏈蛋白多糖和核心蛋白聚糖在發(fā)育性髖脫位關(guān)節(jié)囊及圓韌帶的表達(dá).pdf

1、本研究以DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊和圓韌帶為研究對(duì)象，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原在髖關(guān)節(jié)囊和圓韌帶的分布與定位；應(yīng)用分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)比較Ⅰ、Ⅲ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)在轉(zhuǎn)錄水平和(或)蛋白水平的表達(dá)差異。試圖從分子水平揭示DDH患兒髖關(guān)節(jié)松弛的機(jī)理，是關(guān)節(jié)松馳導(dǎo)致DDH理論的一次深入探索。 研究材料與方法： 一、標(biāo)本采集及處理 發(fā)育性髖脫位髖關(guān)節(jié)囊標(biāo)本33例，來(lái)源方式：手術(shù)

2、復(fù)位中經(jīng)緊縮后切除的髖關(guān)節(jié)上方多余關(guān)節(jié)囊。對(duì)照組兒童髖關(guān)節(jié)囊標(biāo)本17例。在DDH組選擇與對(duì)照組性別相同，年齡相近的9例患兒與對(duì)照組配對(duì)。 發(fā)育性髖脫位髖關(guān)節(jié)圓韌帶標(biāo)本20例，來(lái)源方式：手術(shù)復(fù)位中切除的患髖圓韌帶。對(duì)照組兒童圓韌帶標(biāo)本10例。在DDH組選擇與對(duì)照組性別相同，年齡相近的6例患兒與對(duì)照組配對(duì)。 剪取標(biāo)本為多個(gè)小組織塊：部分置于4％多聚甲醛溶液中室溫固定24小時(shí)，脫水，透明，石蠟包埋，制成5μm切片；部分置于Ep

3、pendorf管中，-80℃深低溫保存。 二、實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo) (一)免疫組織化學(xué)法(SABC法)。觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原在DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中的定位與分布，半定量測(cè)定Ⅰ、Ⅲ型膠原含量。 (二)髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中Ⅰ、Ⅱ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan．和Decorin)轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，R

4、T-PCR)測(cè)定COL1a1、COL3a1、Biglycan和Decorin mRNA水平表達(dá)。 (三)髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白水平檢測(cè)。免疫印跡雜交技術(shù)(Western-Blot)檢測(cè)COL1a1、COL3a1蛋白水平表達(dá)。 三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p<0.05視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著差異。應(yīng)用Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析，配對(duì)比較采用配對(duì)T檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

5、 一、Ⅰ、Ⅲ型膠原的定位、分布與含量。 (一)關(guān)節(jié)囊。 1、Ⅰ型膠原貼近關(guān)節(jié)側(cè)的滑膜層呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，成纖維細(xì)胞及膠原纖維平行滑膜緣排列規(guī)整。纖維層陽(yáng)性表達(dá)有所減弱，膠原纖維排列波浪樣、多級(jí)性，成纖維細(xì)胞散布其間。在性別相同，年齡相近的9例配對(duì)比較中，纖維層中有陽(yáng)性表現(xiàn)的成纖維細(xì)胞數(shù)占總計(jì)數(shù)成纖維細(xì)胞的百分比及膠原染色的灰度值在髖脫位組與對(duì)照組間存在顯著差異(p<0.05)。 2、Ⅲ型膠原僅在DDH組纖維層中出現(xiàn)3

6、例大齡女性患兒陽(yáng)性反應(yīng)：2例為成纖維細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)環(huán)繞棕色深染；1例為細(xì)胞外基質(zhì)網(wǎng)狀棕色深染。 (二)圓韌帶。 1、Ⅰ型膠原。 貼近外周的圓韌帶鞘呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，膠原纖維平行滑膜緣排列規(guī)整。內(nèi)部纖維層陽(yáng)性表達(dá)有所減弱，膠原纖維排列波浪樣、多極性，成纖維細(xì)胞散布其間。在性別相同，年齡相近的6例配對(duì)比較中，纖維層中有陽(yáng)性表現(xiàn)的成纖維細(xì)胞數(shù)占總計(jì)數(shù)成纖維細(xì)胞的百分比及膠原染色的灰度值在DDH組與對(duì)照組間存在顯著差異(p<0

7、.05)。 2、Ⅲ型膠原。 DDH組與對(duì)照組均未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)。 二、Ⅰ、Ⅲ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)mRNA表達(dá)差異。 (一)關(guān)節(jié)囊COL1a1、COL3a1、Biglycan和Decorin mRNA在DDH組表達(dá)較正常對(duì)照組降低(p<0.01)。 (二)圓韌帶COL1a1、Biglycan和Decorin mRNA在DDH組表達(dá)較正常對(duì)照組降低(p<0.01)

8、。COL3a1無(wú)顯著差異(p>0.05)。 三、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)差異。 (一)關(guān)節(jié)囊COI1a1蛋白含量在DDH組較正常對(duì)照組降低(p<0.01)。COL3a1無(wú)顯著差異(P>0.05)。 (二)圓韌帶。 COL1a1蛋白含量在DDH組較正常對(duì)照組降低(p<0.01)。COL3a1無(wú)顯著差異(p>0.05)。 研究結(jié)論： 一、嬰兒期至青春期前DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中旺盛分泌Ⅰ型膠原