2447 nt-489 nt乙型肝炎病毒剪接特異性蛋白與肝細(xì)胞蛋白相互作用研究.pdf

1、HBV基因組剪接變異體(spliced variants of hepatitis B virus genomes)是由HBV前基因組RNA(pregenomic RNA，pgRNA)經(jīng)剪接并逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的亞基因組DNA。長(zhǎng)度為2.2 kb的HBV剪接變異體又稱為2447nt-489nt HBV剪接變異體占80％以上，可編碼剪接特異性蛋白(Hepatitis B spliced protein，HBSP)，并與病毒的持續(xù)性感染及致病性相關(guān)

2、。本實(shí)驗(yàn)室先前利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩查肝細(xì)胞中與HBSP蛋白相互作用的細(xì)胞蛋白，分別獲得纖維蛋白原γ鏈(fibrinogengamma polypeptide，F(xiàn)GG)和微粒體環(huán)氧化物水解酶(microsomal epoxidehydrolase，mEH，編碼基因?yàn)镋PHX1)等幾種候選蛋白。本研究在酵母雙雜交系統(tǒng)初步篩查的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步驗(yàn)證HBSP蛋白分別與FGG和mEH的相互作用，并探討HBSP蛋白對(duì)患者凝血功能與肝臟生物轉(zhuǎn)化功能的影

3、響，從而探索其致病性。
　　 第一部分旨在證實(shí)HBSP與FGG及mEH蛋白間的相互作用。為此，構(gòu)建了pGEX-HBSP載體(用于GST-pull down)、pDsRed-HBSP載體(用于激光共聚焦)、pBIND-HBSP、pBIND-HBSP1-47和pBIND-HBSP64-111載體(用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞雙雜交和免疫共沉淀)；同時(shí)，采用RT-PCR技術(shù)從Huh7細(xì)胞擴(kuò)增得到FGG和EPHX1全長(zhǎng)基因并構(gòu)建pCMVTNT-FG

4、G和pCMVTNT-EPHX1載體(用于體外轉(zhuǎn)錄翻譯)、pAcGFP-FGG和pAcGFP-EPHX1載體(用于激光共聚焦)。體外和體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HBSP蛋白可以和FGG或mEH直接相互作用，而且該相互作用由HBSP蛋白的N端47個(gè)氨基酸介導(dǎo)。
　　 第二部分旨在高效表達(dá)并獲得高純度HBSP融合蛋白，為此，將HBSP全長(zhǎng)基因片段及其N端區(qū)域(編碼N端47個(gè)氨基酸)和C端區(qū)域(編碼N端64個(gè)氨基酸)分別克隆入原核表達(dá)載體pE

5、T43.1a(+)中，并在目的基因的C端引入可編碼StrepⅡ標(biāo)簽蛋白的基因片段，構(gòu)建了pET-43-HBSP-StrepⅡ、pET-43-HBSP1-47-StrepⅡ、pET-43-HBSP48-111-StrepⅡ和對(duì)照質(zhì)粒pET-43-StrepⅡ。之后應(yīng)用IPTG誘導(dǎo)融合蛋白Nus-HBSP-StrepⅡ、Nus-HBSP1-47-StrepⅡ、Nus-HBSP48-111-StrepⅡ和Nus-StrepⅡ在Rosetta(

6、DE3)中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明目的基因獲得高效、可溶性表達(dá)，并通過Strep-Tactin系統(tǒng)親和層析方法純化得到高純度的融合蛋白。
　　 第三部分探討HBSP蛋白對(duì)FGG/mEH相關(guān)功能的影響。應(yīng)用純化后的融合蛋白進(jìn)行纖維蛋白原凝集實(shí)驗(yàn)、血小板粘附實(shí)驗(yàn)和血小板聚集實(shí)驗(yàn)；結(jié)果表明HBSP蛋白可以通過與FGG結(jié)合抑制纖維蛋白原的凝集、干擾血小板對(duì)纖維蛋白原的粘附、激活和ADP引起的血小板聚集，從而抑制凝血功能，且HBSP蛋白的完整