齊整小核菌木質纖維素降解能力及硬葡聚糖合成途徑的研究.pdf

1、木質纖維素生物質可混合糖發(fā)酵為生物能或其它類型的生物材料，一直以來都被認為是一種潛在的可持續(xù)利用的資源。但目前該資源仍未被充分利用，究其原因，主要在于該生物質難于降解和轉化。
　　絲狀真菌齊整小核菌Sclerotium rolfsii作為白腐菌，在前期實驗中發(fā)現(xiàn)它具有很強的木質纖維素降解能力，可直接利用生物質，具有高價值化木質纖維素資源的迷人前景。同時它也是一種用來生產硬葡聚糖的載體微生物，可高效實施生物煉制。硬葡聚糖是一種價值很

2、高的多糖聚合物，是生物煉制的絕佳產物，具有廣泛用途，如工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、食品加工等，現(xiàn)已迅速崛起成為一種重要的有應用前景的的工業(yè)資源。但對 Sclerotium rolfsii 生物合成機制并不了解，本研究為Sclerotium rolfsii硬葡聚糖高效產業(yè)化的實現(xiàn)提供理論基礎。
　　Sclerotium rolfsii木質纖維素降解能力的研究。
　　1. 通過前期系列比對試驗發(fā)現(xiàn)，Sclerotium rolfsii具有強大

3、的降解木質纖維素的能力，基于此，我們對 Sclerotium rolfsii 做全基因組測序。根據基因組結果對Sclerotium rolfsii做了進化樹分析，發(fā)現(xiàn)該菌與黃孢原毛平革菌等多種木質纖維素強降解菌株具有近緣關系。對木質纖維素降解酶相關基因進行分析注釋，得知該菌含有碳水化合物酶基因 1558 個，含有木質素降解酶相關基因 21 個，這兩個數值遠高于或相近于相應基因在有些已報道的相關降解菌中的個數 (如木質纖維素降解模式菌Di

4、chomitus squalens含有碳水化合物酶基因391個，木質素降解酶相關基因12個)。
　　2. 做大量比對實驗進一步驗證Sclerotium rolfsii強降解木質纖維素能力。主要與其它已報道的木質纖維素降解菌對比(Tv: Trametes versicolor, Ds: Dichomitus squalens, Tr:Trichoderma reesei)。通過這些白腐菌對三種典型生物質底物（濾紙、堿性木質素及小麥秸

5、稈）的降解，得出現(xiàn)象：20 天處理后，各菌對濾紙均有不同程度的降解，其中Sclerotium rolfsii培養(yǎng)基中濾紙?zhí)Ч顬槊黠@，該菌對濾紙降解效率高達65％，纖維素酶活約2500U/g；20天處理后，Sclerotium rolfsii對堿木質素降解率可達 38%；30 天處理后的小麥秸稈被各菌不同程度的的分解， Sclerotium rolfsii 對小麥秸稈的降解效果比木質纖維素強降解白腐菌 Trametes versic

6、olor 更明顯，半纖維素，纖維素和木質素各成分與對照相比都有不同程度的減少，其中纖維素量減少尤為明顯。同樣監(jiān)測各培養(yǎng)基中纖維素酶活性，Sclerotium rolfsii纖維素酶活性最高。這些現(xiàn)象充分證明齊整小核菌具有高效降解木質纖維素的能力，本次實驗結果為高效降解木質纖維素菌株提供新的可能性，對深入探究Sclerotium rolfsii降解木質纖維素機制提供理論依據。
　　Sclerotium rolfsii 硬葡聚糖生物合

7、成途徑研究。
　　1.基于文獻報道關于Sclerotium rolfsii合成硬葡聚糖假想代謝通路圖，注釋出該通路中所有相關酶基因，重點分析合成代謝途徑中第五步關鍵酶基因。
　　2.穩(wěn)定兩種不同產硬葡聚糖體系（高產糖及低產糖），并分別做轉錄組測序，找出兩種產糖條件下的差異顯著基因并做差異基因GO富集分析及KEGG富集分析，結果表明在高產硬葡聚糖條件下，與多糖結合位點、堿基化合物轉運相關基因明顯富集。分析硬葡聚糖合成假想通路圖

8、中所有關鍵酶基因在兩種產糖條件下mRNA表達差異，得出高產糖條件下，該通路中大部分相關酶基因均上調。
　　3.基于Sclerotium rolfsii轉錄組數據及文獻報道挑出16個候選內參基因，在8種不同脅迫條件下（pH、溫度、碳氮源及碳氮比）對這些候選基因進行 qRT-PCR定量，并用四個評估程序對定量結果進行穩(wěn)定性評估，綜合分析四種評估結果，最終篩選出三個穩(wěn)定表達的內參基因DUF、HYP與β-TUB,其中前兩個基因是基于轉錄組

9、結果篩選出新的內參基因。為驗證篩選結果的準確性，選取兩個靶基因ZinP及DimL，以DUF、HYP及β-TUB為內參基因，在高產及低產糖條件下對這兩個靶基因進行qRT-PCR相對定量，其定量結果與轉錄結果完全一致，充分驗證了篩選結果的可行性。本次實驗首次為S. rolfsii挑選合適內參基因，為該菌后續(xù)的基因水平定量提供有力保障，同時也為其它白腐菌內參基因的選擇提供了參考。
　　4. Sclerotium rolfsii硬葡聚糖生