內質網應激相關因子在2型糖尿病小鼠主動脈中的表達研究.pdf

1、動脈粥樣硬化是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)常見的并發(fā)癥，80％的DM患者死于動脈粥樣硬化，DM患者發(fā)生動脈粥樣硬化的幾率是非DM患者的2-4倍，而2型糖尿病(type2 diabetes，T2DM)約占整個DM病例的90％。長期以來，研究人員針對DM促發(fā)動脈粥樣硬化的機制做了大量研究。目前，DM致動脈粥樣硬化的發(fā)病機理主要包括:高級糖基化終末產物(advanced glycation end products，AG

2、Es)的形成、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的激活以及氧化應激水平增高。近年來的研究表明，內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)在DM動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。但是ERS作為DM動脈粥樣硬化致病機理的研究才剛剛開始，許多問題尚未明確，其信號轉導途徑的分子機制還有待更深入的研究。
　　因此，為了探討ERS在T2DM動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的作用機制，本實驗

3、通過高脂高糖飲食喂養(yǎng)聯(lián)合6周齡時鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導，在apoE-/-/LDLR-/-(AL)小鼠的基礎上建立了T2DM動脈粥樣硬化小鼠模型，ND組注射檸檬酸緩沖液作對照。小鼠10周齡時，檢測體重、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-insulin resistant，HOMA-IR)以及糖耐量實驗(Glucose tolerance t

4、est，GTT)確定T2DM建模成功。T2DM和ND組小鼠分別于10周齡、18周齡解剖、取材檢測(n≥10)，我們綜合分析了T2DM組小鼠主動脈弓部，根部以及主動脈大體的動脈粥樣硬化病變，檢測了ERS相關因子在主動脈根部的表達，探討了T2DM在動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展中的作用機制，為T2DM動脈粥樣硬化的預防和治療，提供有價值的參考依據。
　　本實驗的結果顯示，1:與 ND組小鼠相比，T2DM組小鼠8周齡時體重低(P＜0.05)，并

5、一直持續(xù)到18周齡。T2DM組小鼠在STZ注射4周即10周齡時表現(xiàn)為高血糖，并持續(xù)至實驗結束(P＜0.01)。另外，T2DM組小鼠表現(xiàn)為胰島素水平升高(P＜0.05)，胰島素抵抗(P＜0.01)。GTT結果顯示，T2DM組小鼠在10周齡和18周齡時與 ND組小鼠相比表現(xiàn)出葡萄糖耐量異常。T2DM組小鼠血清 TC、TG水平較 ND組明顯升高(P＜0.01)，并持續(xù)至18周齡。實驗過程中，T2DM組小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇(low den

6、sity lipoprotein cholesterol，LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)水平一直高于NG組小鼠(P＜0.01)。T2DM組小鼠表現(xiàn)為高血糖、高血脂、IR以及糖耐量異常，以上數(shù)據表明，我們已在AL小鼠的基礎上成功建立了T2DM動脈粥樣硬化小鼠模型，可用于后續(xù)實驗進行。
　　2:為了研究T2DM在動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生中的作用，我們

7、對兩組小鼠主動脈根部和全長主動脈動脈粥樣硬化病變進行分析，結果顯示兩組小鼠10周齡、18周齡主動脈根部瓣膜處均有不同程度的蘇丹Ⅳ陽性染色區(qū)，表明主動脈瓣膜處動脈壁發(fā)生脂質沉積，伴有泡沫細胞聚集。T2DM組小鼠18周齡時，主動脈根部斑塊分布區(qū)域增多，斑塊面積進一步增大，吞噬脂質程度進一步加重，蘇丹Ⅳ染色著色弱，血管壁變薄，在病變嚴重的區(qū)域，斑塊內部出現(xiàn)膽固醇結晶和壞死核心。隨著年齡的增長，兩組小鼠主動脈根部平均病變面積逐漸增大。T2DM組

8、小鼠主動脈根部平均病變面積較 ND組在10周齡有顯著性差異(P＜0.05)，18周齡有極顯著性差異(P＜0.01)。全長主動脈油紅 O染色顯示內表面病變，T2DM小鼠10周齡、18周齡全長主動脈油紅 O陽性染色區(qū)域明顯高于同年齡段 ND組小鼠。
　　3:實時定量 PCR結果顯示，與 ND小鼠相比，T2DM組小鼠10周齡時 ERS標志因子(glucose-regulated protein78，GRP78)、(C/EBP homol

9、ogous protein，CHOP)表達水平明顯升高，并持續(xù)至18周齡。T2DM組小鼠細胞凋亡途徑相關因子 Caspase12、JNK2表達水平在18周齡時顯著升高，并與 ND組有顯著性差異(P＜0.01)。
　　GRP78免疫組化結果顯示，在動脈粥樣硬化初期，ND組小鼠10周齡時ERS標志性因子GRP78在斑塊內已有較高的表達，其中T2DM組較ND小鼠斑塊內GRP78表達增加。在動脈粥樣硬化晚期，T2DM組小鼠18周齡時主動脈

10、粥樣硬化斑塊中膜平滑肌處GRP78有較高表達，ND組則無明顯表達。ERS標志因子CHOP是ERS促凋亡途徑的特有產物，其編碼的蛋白質屬于CCAA/增強子相連蛋白的轉錄因子C/EBP家族，與各種細胞活動如能量代謝、增殖、分化及凋亡相關。CHOP阻滯細胞分裂周期可誘導細胞凋亡。CHOP免疫組織化學結果顯示，在ND組小鼠10周齡和18周齡時，主動脈粥樣硬化斑塊內CHOP表達非常低。T2DM組小鼠10周齡時，CHOP在主動脈粥樣硬化斑塊內已有表

11、達，在動脈粥樣硬化晚期，T2DM組小鼠18周齡時CHOP表達增加。Actived-Caspase3免疫組化結果顯示，T2DM組小鼠在10周齡時斑塊內出現(xiàn)細胞凋亡，18周齡時凋亡增加，ND組則未出現(xiàn)明顯的細胞凋亡。動脈粥樣硬化斑塊內細胞凋亡會直接造成壞死核心的形成以及斑塊不穩(wěn)定，動脈粥樣硬化斑塊內壞死核心面積分析結果顯示，T2DM組小鼠18周齡時主動脈粥樣硬化斑塊壞死核心面積較ND組小鼠顯著升高(P＜0.01)。
　　以上結果表明，