環(huán)氧合酶-2基因敲低對嘌呤霉素氨基核苷誘導的足細胞凋亡影響的實驗研究.pdf

1、第一部分環(huán)氧合酶-2基因敲低對足細胞凋亡及 nephrin蛋白表達的影響
　　目的：研究發(fā)現(xiàn)嘌呤氨基核苷可以誘導條件永生性小鼠足細胞凋亡，其中 COX-2的表達增加，使用特異性COX-2抑制劑塞來昔布可使足細胞凋亡減輕。但塞來昔布抑制足細胞凋亡可能并不完全依賴對COX-2的調節(jié)。為了證明足細胞 COX-2表達降低是塞來昔布抑制凋亡的機制，本實驗增加COX-2特異性小干擾RNA（small interfere RNA，siRNA）實

2、驗，將足細胞COX-2基因敲低，探討COX-2表達降低對足細胞凋亡及nephrin蛋白表達的影響。
　　方法：以條件永生性小鼠足細胞株為研究對象：分為正常對照組、5μl的siRNA組、10μl的siRNA組、15μl的siRNA組。經誘導分化成熟，在干擾48 h后用半定量RT-PCR和Western bolt分別檢測COX-2 mRNA及蛋白表達水平，用流式細胞儀檢測足細胞凋亡水平。2.以10μl的siRNA組作為研究對象，分別設

3、立足細胞正常對照組、足細胞COX-2基因敲低組和足細胞陰性轉染對照組，用Western bolt檢測nephrin蛋白、BAX蛋白及BCL-Xl蛋白的表達水平。
　　結果：1．與正常對照組比較，隨著干擾濃度的增加，COX-2mRNA及蛋白表達逐漸減少，而足細胞的凋亡率逐漸升高，15μl的siRNA組凋亡率明顯增高。2．10μl COX-2 siRNA轉染組 nephrin蛋白表達顯著低于陰性轉染組(P<0.05)。3.與陰性轉染組

4、相比，10μl COX-2 siRNA轉染組Bax蛋白表達顯著上調，而Bcl-xl蛋白表達稍有下調。
　　結論：1.敲低COX-2的基因表達可以導致足細胞凋亡，并隨著干擾濃度的增加，足細胞凋亡率逐漸增加。2.在干擾濃度為10μl時，足細胞nephrin蛋白的表達下調，3.而BAX蛋白上調及BCL-Xl蛋白下調參與了足細胞的凋亡。
　　第二部分環(huán)氧合酶-2基因敲低對嘌呤霉素氨基核苷誘導的足細胞凋亡的影響
　　目的：我們在

5、前期試驗中采用體外培養(yǎng)的條件永生性小鼠足細胞為研究對象，發(fā)現(xiàn)在嘌呤霉素氨基核苷誘導的足細胞凋亡過程中COX-2的表達隨時間延長是逐漸增多，而特異性COX-2抑制劑塞來昔布則可以減少PA誘導的足細胞凋亡，推測塞來昔布抑制足細胞凋亡的作用可能是通過抑制COX-2的表達實現(xiàn)的。但塞來昔布抑制凋亡可能并不完全依賴對COX-2的調節(jié)。本實驗在前期實驗的基礎上，應用COX-2 siRNA干擾技術將實驗中足細胞COX-2基因敲低，觀察嘌呤霉素氨基核苷

6、誘導凋亡的小鼠足細胞中COX-2的表達水平及足細胞nephrin及CD-2AP的表達，進一步研究足細胞COX-2基因敲低對足細胞保護的作用機制。
　　方法：以條件永生化小鼠足細胞株為研究對象，分組如下：1.足細胞對照組(A組)、2.足細胞嘌呤霉素氨基核苷組(B組)、3.足細胞嘌呤霉素氨基核苷+塞來昔布組(C組)、4.足細胞塞來昔布組(D組)、5.足細胞陰性轉染對照組(E組)、6.足細胞COX-2基因敲低組(F組)、7.足細胞COX

7、-2基因敲低+嘌呤霉素氨基核苷組(G組)、8.足細胞COX-2基因敲低+塞來昔布組(H組)，MTT法及流式細胞儀檢測各組細胞凋亡百分率，用Western bolt檢測各組細胞COX2、Nephrin、CD2AP蛋白的表達水平。
　　結果:1.與A組比較，B組COX-2表達明顯上調，細胞凋亡百分率明顯增加，Nephrin、CD2AP蛋白表達明顯下調，C組細胞凋亡百分率較B組低；2. F組及G組兩組足細胞凋亡百分率較E組高，G組細胞凋