Notch信號(hào)在小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后神經(jīng)元死亡中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是指由諸如剪切、撕扯、牽拉等性質(zhì)的機(jī)械力對(duì)腦組織所造成的物理性損傷，可導(dǎo)致挫傷、出血和水腫等即刻的臨床效應(yīng)。TBI是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病，致殘、死率極高。研究發(fā)現(xiàn)，引起 TBI的主要機(jī)制包括谷氨酸興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等等，而這些病理機(jī)制作用的最終結(jié)果則導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡及其相關(guān)功能的喪失。嚴(yán)重腦損傷患者即使被挽救生命，但因?yàn)樯窠?jīng)

2、元的死亡是無(wú)法再生替代的，因此損傷引起患者的多種功能缺陷仍的后期恢復(fù)還缺乏有效的治療措施，給家庭與社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神負(fù)擔(dān)。目前對(duì) TBI后分子代謝及調(diào)控的機(jī)制還不十分清楚。因此，積極探索內(nèi)源性調(diào)控神經(jīng)元死亡和存活的關(guān)鍵分子成為TBI治療的重要策略。
　　Notch信號(hào)作為一類在物種進(jìn)化過(guò)程中高度保守的信號(hào)通路，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。累積的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在多種不同類型的腦損傷模型中均存在Notch信號(hào)

3、的激活。通過(guò)化學(xué)抑制劑或基因調(diào)控的方法抑制 Notch信號(hào)的活性及表達(dá)在缺血性腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。然而，一些研究也報(bào)道抑制Notch信號(hào)加重了缺血性腦損傷后的神經(jīng)細(xì)胞損傷。這些矛盾的結(jié)論使Notch在神經(jīng)元損傷中的作用充滿爭(zhēng)議。因此，探索并了解Notch信號(hào)在TBI后發(fā)揮何種作用及相關(guān)的作用機(jī)制對(duì)于TBI的救治來(lái)說(shuō)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?br>　?。?）探索Notch在TBI后的時(shí)空變化規(guī)律及功能；（2）

4、探索Notch在TBI后神經(jīng)元凋亡和自噬中的作用及相關(guān)的機(jī)制；（3）探索TBI后自噬對(duì)凋亡的影響作用。實(shí)驗(yàn)方法
　?。?）細(xì)胞培養(yǎng)：離體的皮層神經(jīng)元培養(yǎng)；（2）造模：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用液壓打擊致腦損傷模型，離體實(shí)驗(yàn)使用機(jī)械性劃傷模型，分別模擬在體與離體條件下的創(chuàng)傷性腦損傷；（3）神經(jīng)元致傷效果：采用 LDH試劑盒檢測(cè)細(xì)胞損傷破壞的程度，采用CCK8試劑盒檢測(cè)神經(jīng)元損傷后的存活數(shù)量；（4）分子表達(dá)與空間定位：分別采用免疫熒光、Wester

5、n blot及免疫組化等方法檢測(cè)主要分子的表達(dá)規(guī)律及空間定位；（5）腦損傷程度：采用干濕重法檢測(cè) TBI后小鼠腦水腫的程度；采用神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分評(píng)估TBI后小鼠神經(jīng)功能受損的程度；（6）細(xì)胞凋亡：western blot、Caspase檢測(cè)試劑盒以及TUNEL染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；（7） Notch調(diào)控：利用 Notch信號(hào)抑制劑 GSI及下調(diào)Notch信號(hào)在神經(jīng)元的表達(dá)，采用Notch激動(dòng)劑重組鼠jagged1蛋白上調(diào)Notch信號(hào)的活性；

6、（8）ERK通路調(diào)控：使用特異性阻斷劑PD98059抑制ERK通路的活性；（9）自噬調(diào)控：利用自噬抑制劑3-MA和自噬激動(dòng)劑雷帕霉素分別來(lái)下調(diào)和上調(diào)自噬，并通過(guò)檢測(cè)LC3的蛋白表達(dá)反應(yīng)自噬水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一：與對(duì)照組比較，離體神經(jīng)元機(jī)械性劃傷模型可在傷后1h顯著升高神經(jīng)元LDH的漏出并減少存活細(xì)胞數(shù)量；劃傷后6h在光鏡下可見(jiàn)視野內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，Hochest染色顯示神經(jīng)元中的凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增加，透射電鏡

7、下可看到雙層膜的自噬體，免疫熒光結(jié)果顯示 NICD主要定位于胞漿和胞核。在小鼠液壓打擊腦損傷模型中：與對(duì)照組比較 TBI后出現(xiàn)明顯腦水腫及神經(jīng)功能障礙；TBI24h后TUNEL染色顯示損傷側(cè)皮層中TUNEL染色陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，DAB染色顯示 NICD陽(yáng)性細(xì)胞較對(duì)照組顯著增加，主要定位在損傷側(cè)皮層部位神經(jīng)元的胞核中。
　　此外，離體和在體的western blot檢測(cè)均顯示：TBI后神經(jīng)元中NICD、活化caspase3與

8、LC3Ⅱ的表達(dá)均早期開(kāi)始上調(diào)，達(dá)到峰值后逐漸回落。
　　實(shí)驗(yàn)二：分別在離體和在體模型上給予Notch信號(hào)抑制劑GSI預(yù)處理，兩種模型上NICD的表達(dá)均受到明顯抑制。GSI顯著降低離體神經(jīng)元機(jī)械性劃傷6h后LDH漏出并增加了細(xì)胞存活。Western blot檢測(cè)顯示GSI明顯降低了細(xì)胞劃傷后的caspase3和LC3的激活。在體模型中與TBI組相比，GSI明顯降低了TBI后小鼠腦含水量并改善了其功能學(xué)評(píng)分，western blot檢

9、測(cè)同樣顯示 GSI預(yù)處理明顯降低了活化caspase3和LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)量，TUNEL檢測(cè)顯示給予GSI處理降低了TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞量。
　　實(shí)驗(yàn)三：離體培養(yǎng)的神經(jīng)元機(jī)械性劃傷后磷酸化ERK的表達(dá)從傷后1h出現(xiàn)高表達(dá)，隨后逐漸回落至24h恢復(fù)正常水平。使用ERK抑制劑PD98059預(yù)處理可明顯降低磷酸化ERK水平，同時(shí)活化caspase3和LC3Ⅱ的表達(dá)也受到明顯抑制。PD98059顯著降低離體神經(jīng)元機(jī)械性劃傷后 LDH漏出并增

10、加了細(xì)胞存活率。使用 GSI抑制Notch信號(hào)后，發(fā)現(xiàn)磷酸化ERK明顯下降。同時(shí)給予Notch激動(dòng)劑jagged1和PD98059后發(fā)現(xiàn)jagged1可明顯上調(diào)損傷后NICD、磷酸化ERK、活化caspase3和LC3Ⅱ的蛋白表達(dá)，而jagged1的這些作用可被PD98059明顯抑制.
　　實(shí)驗(yàn)四：離體培養(yǎng)的神經(jīng)元機(jī)械性劃傷前1h給予自噬抑制劑3-MA和激動(dòng)劑雷帕霉素預(yù)處理。損傷后6h發(fā)現(xiàn)3-MA可明顯降低LC3Ⅱ表達(dá)和神經(jīng)元存活

11、率并增加細(xì)胞LDH漏出，TUNEL染色顯示3-MA明顯增加了TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)雷帕霉素則發(fā)揮了完全相反的作用。最后使用caspase活性試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)激活自噬可能通過(guò)調(diào)控線粒體caspase9活性來(lái)影響凋亡。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　我們的研究結(jié)果證實(shí)，TBI后阻斷Notch信號(hào)可產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)；Notch信號(hào)可能與ERK相互作用共同調(diào)節(jié)了TBI后神經(jīng)元的凋亡和自噬；自噬在TBI后發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用且調(diào)控自噬可影響TB