低氧對線粒體自噬的影響及BNIP3介導的調(diào)控作用研究.pdf

1、氧作為細胞代謝線粒體氧化磷酸化的重要底物，對細胞的存活具有重要的調(diào)節(jié)作用。近年來越來越多的研究顯示:適度低氧促進細胞的增殖和存活;而嚴重低氧導致細胞的死亡。研究不同低氧條件下細胞代謝水平的改變，有助于人們更深入地了解機體對低氧的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機制。當細胞遭受低氧刺激時，因為線粒體電子傳遞鏈中作為電子最終受體的氧分子供應(yīng)不足，導致電子傳遞鏈(ElectronTransport Chain，ETC)產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive Oxyge

2、n Species，ROS)，大量產(chǎn)生的活性氧會對細胞中大分子和細胞器造成損傷，最終導致細胞功能紊亂或細胞死亡。
　　線粒體自噬(mitophagy)是近年來被發(fā)現(xiàn)的細胞在多種應(yīng)激刺激下的一種適應(yīng)性代謝反應(yīng)。自噬過去一直被視為細胞死亡的一種方式，近年來隨著對自噬研究的深入，自噬被發(fā)現(xiàn)作為一種重要的機體適應(yīng)性反應(yīng)，在機體應(yīng)對應(yīng)激環(huán)境時行使重要的促存活作用。線粒體自噬作為自噬的一種形式，能通過自噬-溶酶體途徑特異性地降解受損的線粒體，

3、維持細胞中活性氧的水平，防止細胞中因為ROS、MMP(Mitochondrial Membrane Potential)等造成的線粒體內(nèi)容物的釋放和線粒體途徑的細胞凋亡或壞死。因此，線粒體自噬被認為在多種應(yīng)激條件下發(fā)揮著重要的促存活作用。近期研究表明，細胞在低氧條件下能通過激活低氧誘導因子(Hypoxia-Inducible Factor1,HIF-1)和BNIP3(Bcl-2 and adenovirus E1B19kDa-inter

4、acting protein3)介導的PI3K(phosphatidylinositol-3-kinase)通路誘導線粒體自噬，減少活性氧ROS的產(chǎn)生，促進細胞的存活和低氧適應(yīng)。
　　BNIP3是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員，它是一種線粒體外膜蛋白，也是HIF-1的靶基因。在低氧時能被HIF-1轉(zhuǎn)錄激活，使BNIP3表達上調(diào)。早期的研究顯示低氧下BNIP3在線粒體途徑的凋亡和壞死中起重要作用。近幾年越來越多的研究證

5、明BNIP3在線粒體自噬中也發(fā)揮著重要作用。因而，關(guān)于低氧下BNIP3的功能探討存在著兩種不同的觀點。
　　在本研究中，我們探討了不同氧濃度下線粒體自噬的發(fā)生;其對細胞存活的影響，以及BNIP3在不同氧濃度下表達和對線粒體自噬及細胞存活的影響。研究中，我們用0.3％ O2和10％ O2為低氧模型，檢測不同氧濃度對PC12細胞存活與線粒體自噬的影響，并進一步探討了BNIP3在不同低氧條件下對線粒體自噬的調(diào)控作用。
　　主要研究

6、結(jié)果如下:
　　1.不同低氧對細胞存活狀態(tài)的影響
　　我們采用適度低氧(10％ O2，24 h)和嚴重低氧(0.3％ O2，24 h)兩種低氧模型，通過比較不同氧濃度下細胞存活率，總抗氧化能力（Total Anti-Oxidantcapacity，T-AOC），活性氧含量，細胞凋亡和增殖能力，確定適度低氧和嚴重低氧對細胞存活狀態(tài)的影響。
　　1.1細胞存活
　　我們通過MTT實驗比較不同氧濃度，不同低氧處理時間對

7、不同接種密度下PC12細胞存活能力的影響。實驗結(jié)果表明:經(jīng)10％ O2低氧處理24 h和48 h后存活能力都顯著增加;而0.3％ O2低氧條件下，低氧處理24 h或48 h，均明顯抑制PC12細胞的存活。
　　1.2總抗氧化能力
　　我們進一步通過總抗氧化能力試劑盒檢測了PC12細胞的總抗氧化能力。結(jié)果顯示:10％O2處理24 h后，細胞的總抗氧化力較常氧組有升高的趨勢，但無統(tǒng)計學差異;0.3％ O2處理24 h后，細胞的總

8、抗氧化能力較常氧組明顯地降低。
　　1.3活性氧含量
　　此外，我們用熒光標記的ROS分子探針孵育細胞，染色后檢測結(jié)果顯示:與常氧對照相比，10％ O2處理24 h后，細胞經(jīng)過ROS探針分子染色后熒光強度無顯著變化。0.3％ O2處理24 h后，細胞經(jīng)過ROS探針分子染色后的熒光強度增加了約2倍。
　　1.4細胞凋亡
　　由于ROS大量產(chǎn)生是誘導細胞凋亡的機制之一，我們進一步通過TUNEL染色、AnnexinⅤ/

9、PI雙染和Western Blot檢測凋亡標記分子caspase-3和caspase-9的剪切活化觀察了不同氧濃度對PC12細胞凋亡的影響。實驗結(jié)果顯示，在常氧和10％ O2處理24 h后，細胞的凋亡率較低，而經(jīng)過0.3％ O2處理24 h后，PC12細胞的凋亡率顯著升高。
　　1.5細胞增殖
　　不同低氧條件下，除了細胞凋亡影響細胞的存活外，低氧對細胞增殖的作用也會影響細胞的存活數(shù)目。因此，我們又進一步檢測了不同低氧對細胞

10、增殖的影響。通過PI染色流式檢測細胞周期和BrdU摻入法觀察不同氧濃度下PC12細胞的增殖狀態(tài)。結(jié)果顯示:10％ O2處理24 h后細胞增殖較常氧無顯著變化，0.3％O2處理24h后細胞增殖減少。
　　通過上述實驗，我們確定了適度低氧(10％ O2，24 h)和嚴重低氧(0.3％ O2，24 h)兩種不同低氧模型，PC12細胞在兩種不同氧濃度下存活狀態(tài)截然不同。
　　2.不同低氧對線粒體自噬的影響及線粒體自噬在細胞存活狀態(tài)中

11、的作用
　　線粒體自噬是新近報道的低氧條件下減少過量ROS產(chǎn)生的適應(yīng)性代謝反應(yīng)。不同氧濃度對線粒體自噬的發(fā)生有何影響？細胞對不同低氧刺激的迥異反應(yīng)是否通過對線粒體自噬的不同調(diào)節(jié)來實現(xiàn)的？為闡明這些問題，我們分別進行了以下實驗研究。
　　2.1不同低氧下的線粒體自噬
　　將PC12細胞進行適度低氧(10％ O2)和嚴重低氧(0.3％O2)處理24小時后，我們用電子顯微鏡、Western Blot和熒光共定位分析等檢測方法

12、，觀察了不同低氧條件對PC12細胞線粒體自噬的影響。與常氧對照相比，適度低氧促進細胞中線粒體自噬的發(fā)生;而嚴重低氧后，線粒體自噬明顯減少。
　　2.2抑制線粒體自噬對細胞存活狀態(tài)的影響
　　為進一步確定線粒體自噬在不同低氧中對細胞存活狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用，我們用自噬抑制劑3-MA處理PC12細胞，然后分別觀察了細胞存活能力，活性氧含量和細胞凋亡情況，以鑒別線粒體自噬對細胞存活狀態(tài)的影響。(1) MTT檢測細胞存活率的結(jié)果顯示:在常

13、氧和適度低氧條件下，不同濃度的3-MA處理均能導致細胞存活率顯著降低;而在嚴重低氧條件下，不同濃度的3-MA處理對細胞存活率的影響均不明顯。(2) ROS探針分子檢測細胞活性氧含量的結(jié)果顯示:常氧條件下，細胞經(jīng)過3-MA處理后ROS陽性細胞的數(shù)量無顯著變化;而在適度低氧條件下，3-MA處理后ROS的陽性細胞率增加顯著;在嚴重低氧條件下，3-MA處理后ROS陽性細胞率也有所增加。(3) TUNEL檢測細胞凋亡的結(jié)果顯示:常氧條件下，細胞經(jīng)

14、過3-MA處理后凋亡率并未顯著升高，而在適度低氧和嚴重低氧條件下，3-MA處理均能誘導細胞凋亡增多。
　　2.3比較線粒體自噬和凋亡對細胞存活狀態(tài)的影響
　　適度低氧和嚴重低氧時PC12細胞中線粒體自噬和細胞凋亡的發(fā)生相反，為了明確這兩種低氧條件下細胞是以促進細胞存活的線粒體自噬為主要途徑，還是促進細胞死亡的凋亡途徑占主導作用？我們同時使用了抑制凋亡途徑的抑制劑Z-VAD和抑制自噬發(fā)生的抑制劑3-MA，分別通過MTT和TUN

15、EL染色觀察了抑制自噬與凋亡后細胞存活能力的改變情況。結(jié)果顯示:適度低氧條件下，3-MA處理后細胞凋亡增加，細胞存活率降低，而Z-VAD處理對細胞的存活狀態(tài)無顯著影響;在嚴重低氧條件下，3-MA處理后細胞凋亡和存活率均無顯著影響，而Z-VAD處理后細胞的凋亡降低，同時細胞存活率升高。
　　3.低氧對BNIP3表達的影響及其對線粒體自噬的調(diào)控作用
　　3.1不同低氧下的BNIP3表達
　　我們檢測了不同氧濃度處理24 h

16、后BNIP3表達情況。實驗結(jié)果顯示:在常氧條件下，BNIP3有少量的表達;適度低氧處理后，BNIP3的表達顯著升高;而嚴重低氧處理后，BNIP3的表達顯著降低。
　　我們進一步用real-time PCR和Western Blot技術(shù)檢測了BNIP3 mRNA和蛋白在不同時間點的表達情況。實驗結(jié)果顯示:適度低氧條件下，BNIP3rnRNA和蛋白水平隨著低氧時間而逐漸增加;嚴重低氧條件下，BNIP3 mRNA表達隨著低氧時間明顯增加

17、，而其蛋白表達卻表現(xiàn)出先升后降的特點，這表明BNIP3蛋白的表達可能存在翻譯后修飾的調(diào)控。
　　3.2 BNIP3過表達對線粒體自噬的影響
　　用帶有flag標簽的BNIP3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC12細胞，我們通過Western Blot檢測線粒體自噬的標記分子，結(jié)果顯示過表達BNIP3能顯著增加線粒體自噬的發(fā)生。
　　3.3 BNIP3 siRNA對細胞存活、凋亡和線粒體自噬的影響
　　用BNIP3 siRNA轉(zhuǎn)染PC1

18、2細胞，我們分別通過MTT、 Western Blot和TUNEL染色檢測了不同低氧條件下BNIP3表達被抑制后對細胞存活、凋亡以及線粒體自噬的影響。結(jié)果顯示:適度低氧時，BNIP3 siRNA處理后抑制線粒體自噬的發(fā)生和細胞存活;而嚴重低氧時，抑制BNIP3的表達后，對細胞存活、凋亡和線粒體自噬無明顯影響。
　　綜上所述，本研究證明了適度低氧條件(10％ O2)下，PC12細胞通過線粒體自噬清除細胞中的過量ROS，維持氧化還原平