A型核纖層蛋白前體相互作用蛋白的篩選、鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、廣東醫(yī)學院碩士學位論文A型核纖層蛋白前體相互作用蛋白的篩選、鑒定及其功能的初步研究姓名：劉振杰申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：劉新光;梁念慈20080501A 型核纖層蛋白前體相互作用蛋白的篩選、鑒定及其功能的初步研究中文摘要目的與背景：隨著老年社會的到來，有關衰老的研究就非常必要。兒童早老癥( H u t c h i n s o n - G i l f o r d P r o g e r i aS y n d r

2、 o m e ，H G P S ) 是一種非常罕見的遺傳疾病。H G P S 的病因是由于A 型核纖層蛋白前體( p r e l a m i nA ) 力f l T 異常，產生截短5 0 個氨基酸的蛋白所致；而p r e l a m i n A 加工所需的金屬蛋白酶Z m p s t e 2 4 缺失導致p r e l a m i nA 不能被正常加工，出現大量堆積，同樣表現出典型早衰的現象?？梢妏 r e l a m i n A的加工

3、過程與衰老密切相關，這個過程很可能通過p r e l a m i nA 相互作用蛋白來實現。本研究采用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選p r e l a m i n A 相互作用蛋白，并對部分蛋白的功能進行了初步的研究。方法：將預轉人骨骼肌細胞e D N A 文庫酵母菌Y 1 8 7 ( 含A D 質粒) 與無自主激活的酵母菌A H l 0 9 ( 含B D 質粒) 雜交融合后得到初篩候選陽性克隆；提取質粒并電擊轉化大腸桿菌J M l 0 9 獲得單

4、一文庫質粒再進行自主激活報告基因檢測和一對一回復性雜交實驗，最后篩選出真陽性克隆( 即與人p r e l a m i nA 相互作用的蛋白) 。經上述一對一回復確證為陽性相互作用的A D 質粒，以p A C T 2 質粒的通用引物為測序引物測定該質粒的插入片段e D N A 序列。并通過N C B I 進行B L A S T 分析，最終確定這些相互作用蛋白的名稱。將確定的蛋白的A D 質粒與B D 質粒p G B K T 7 ．L A

5、．C ，p G B K T 7 一P L A 和p G B K T 7 ．L A 再次進行一對一回復性雜交，確定這些相互作用蛋白與p r e l a m i nA 全長以及l(fā) a m i nA 蛋白的相互作用情況。用G S Tp u l l ．d o w n 在細胞外進一步證實蛋白質問的相互作用，并運用R T ．P C R 及熒光蛋白融合表達了解該蛋白在人胚腎細胞內的表達情況。結果：以p r e l a m i n A 的C 末端為誘餌

6、蛋白篩選出2 1 個陽性相互作用的蛋白。序列比對結果發(fā)現其中l(wèi) 8 個為己知蛋白，3 個為未知新蛋白。與全長p r e l a m i nA 和l a m i nA 蛋白一對一回復性雜交發(fā)現其中2 0 個蛋白與兩者均能結合，僅有N a r f 不與l a m i nA 蛋白相互作用，為p r e l a m i n A 特異結合蛋白。G S T p u l l ．d o w n 結果進一步證實了人金屬硫蛋白M T ．2 A 與人l a