人骨髓間充質(zhì)干細胞體外定向誘導分化為心肌樣細胞.pdf

1、目的：探討體外誘導人骨髓間充質(zhì)干細胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBMSCs)定向誘導分化為心肌樣細胞的實驗條件。 方法：取成人棄骨骨髓，通過全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)hBMSCs。在傳至第三代時，篩選具有心肌特異性分化潛能的c-kit<'+>的hBMSCs細胞克隆，用含20％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)克隆培養(yǎng)。當細胞達到70％融合時，分別用10μtmol/

2、15-氮胞苷(5-azacytidine crystalline，5-aza)，100mg/l參麥注射液，10μmol/15-氮胞苷和100mg/l參麥注射液3組誘導劑誘導hBMSCs。24小時后，更換為含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。在誘導3周后，通過顯微鏡下觀察其形態(tài)變化。用免疫細胞化學方法檢測心肌特異性標記抗原Desmin和肌鈣蛋白T的表達；用RT-PCR方法檢測心肌特異基因心房利尿肽(atrial natriure

3、tic peptide，ANP)和腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)表達。 結果：骨髓中含有多種hBMSCs細胞克隆，其中成纖維細胞樣克隆表達c-kit<'+>。分別用3組誘導劑誘導c-kit<'+>細胞15天后，部分細胞胞體明顯增粗，可見有些細胞間有融合樣現(xiàn)象發(fā)生。誘導3周后，3組都有類似肌管樣細胞出現(xiàn)，細胞短粗，呈不規(guī)則的圓柱形，有分支，互相連成網(wǎng)。蘇木精-伊紅(hematoxylin-eo

4、sin HE)染色后，3組細胞都排列規(guī)則，類似于心肌細胞的形態(tài)，可見部分細胞有排列規(guī)則的橫紋樣結構。免疫細胞化學顯示誘導3周后的hBMSCs，Desmin陽性細胞數(shù)目分別是：5-aza組(65.3±4.7％)，參麥注射液組(62.3±3.9％)，5-aza和參麥注射液組(68.5±2.1％)，3組Desmin陽性細胞表達率無顯著差異：cTnT陽性細胞數(shù)目分別是：5-aza組(62.2±4.1％)，參麥注射液組(63.8±3.4％)，5-

5、aza和參麥注射液組(66.0±6.2％)，3組Desmin陽性細胞表達率無顯著差異。陰性對照組和未分化的hBMSCs均無Desmin和cTnT的表達。RT-PCR顯示3種不同的誘導劑誘導hBMSCs3周后都有ANP，BNP的表達，未分化的hBMSCs無ANP，BNP的表達。 結論：5-aza和中藥可以誘導c-kit<'+>的hBMSCs細胞克隆分化為心肌樣細胞。體外誘導成的心肌樣細胞表現(xiàn)為未成熟心肌細胞的結構和功能特征。證明骨