桂皮醛抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)生物膜形成的實驗研究.pdf

1、目的:分別通過體內(nèi)和體外實驗研究證明桂皮醛(cinnamaldehyde,CA)對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)形成生物膜的抑制作用；并檢測桂皮醛對MRSA生物膜形成關(guān)鍵基因sarA以及體內(nèi)試驗動物血清中炎癥因子IL-1β的影響,為進(jìn)一步探討桂皮醛的作用機制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.將實驗菌株(包括6株MRSA和1株標(biāo)

2、準(zhǔn)菌株ATCC25923)接種L-B瓊脂平板,37℃培養(yǎng)24h,然后行K-B法和微量瓊脂稀釋法藥敏試驗,測得抑菌環(huán)直徑,最低抑菌濃度(minimum inhibitoryconcentration,MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidalconcentration,MBC)；
　　 2.利用96孔板法構(gòu)建MRSA生物膜,分別加入不同濃度的藥物(包括0.5×,1×,2.5×和5×MIC),作用24h后分別采

3、用MTT法和菌落計數(shù)法測定生物膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量的變化；
　　 3.分別采用掃描電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡對上述桂皮醛對MRSA生物膜的作用加以驗證；
　　 4.利用PCR方法檢測各待測菌株內(nèi)有無icaA和sarA兩種基因；
　　 5.不同濃度的桂皮醛作用MRSA生物膜24h后,提取細(xì)菌細(xì)胞總RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測用藥前后sarAmRNA水平的變化；
　　 6.在體內(nèi),采用皮下羧甲

4、基纖維素鈉(CMC)-囊袋法制備MRSA在SD大鼠體內(nèi)的生物膜模型,并給模型大鼠分別連續(xù)腹腔注射桂皮醛(cinnamaldehyde,CA)30、45、60(mg／(kg.d))4d,同時設(shè)生理鹽水對照組和生物膜模型組；
　　 7.在給藥后的第1d、3d、5d采集菌液進(jìn)行菌落計數(shù),末次給藥后24h斷頭取血,收集病變組織,進(jìn)行病理切片觀察；用RT-PCR檢測血中IL-1βmRNA的變化；用酶聯(lián)免疫法測定血清中IL-1β含量的變化。

5、
　　 結(jié)果:
　　 1.從K-B法藥敏試驗結(jié)果可以看出:抑菌環(huán)直徑隨加藥濃度的增大而增大。當(dāng)加藥濃度為4％(v／v)時,各測試菌株的抑菌環(huán)直徑均≥26mm,達(dá)到了藥敏試驗敏感的范圍；微量瓊脂稀釋法測得各待測菌株的MIC和MBC值的范圍分別為0.0625％-0.125％(v／v)和0.25％-0.5％(v／v)；
　　 2.96孔板法成功制備MRSA生物膜；加入不同濃度藥物后,MTT法和菌落計數(shù)法測得的結(jié)果一致,

6、即隨加藥濃度的增大,生物膜內(nèi)菌落數(shù)量減少；
　　 3.掃描電子顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡下分別觀察到桂皮醛對MRSA形成生物膜的破壞作用,且隨加藥濃度的增大,生物膜結(jié)構(gòu)破壞越大,膜內(nèi)菌落數(shù)越少；
　　 4.PCR結(jié)果顯示各測試菌株均無icaA基因,而含有sara基因；
　　 5.除菌株JB-06外,其他測試菌株在加入0.5×MIC濃度桂皮醛藥液后sarA基因mRNA水平降低；
　　 6.SD大鼠皮下注入金黃

7、色葡萄球菌菌液4天后形成皮下CMC-囊袋生物膜模型；
　　 7.SD大鼠腹腔注射不同濃度桂皮醛藥液后1d,3d和5d分別進(jìn)行菌落計數(shù),發(fā)現(xiàn)隨時間延長菌落數(shù)減少；病理組織切片觀察到炎癥隨加藥時間延長有愈合傾向；血中IL-1βmRNA水平在加藥后減低,ELISA法測得血中IL-1β含量隨加藥濃度增大而減少。
　　 結(jié)論:
　　 本研究通過體外和體內(nèi)試驗分別證實了桂皮醛對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌形成生物膜的抑制作用；并