Rictor在結腸腫瘤發(fā)展中多向性調控的研究.pdf

1、南方醫(yī)科大學2 0 0 9 級博士學位論文R i c t o r 在結腸腫瘤發(fā)展中多向性調控的研究T H E M U I J I P L E R E G U L A T I o N S o F R I C T o R I NC o L o R E C T A L C A N C E R P R o G R E S S I O N課題來源： 自選專‘業(yè) 名 稱學位申請人指 導 教 師答辯委員會主席答辯委員會成員內科學( 消化系病)郭 蒸張

2、亞歷教授王青定教授王繼德教授胡品津教授李瑜元教授毛 華教授聶玉強教授智發(fā)朝教授論文評閱人 陳其奎教授沙衛(wèi)紅教授張振書教授2 0 1 2 年5 月1 日中文摘要2 、方法2 ．1 細胞培養(yǎng)2 9 3 T 細胞使用含1 0 ％F B S 的D M E M 培養(yǎng)，H T 2 9 和H C T l 1 6 細胞采用含1 0 ％F B S 的M c C o y ' s 5 A 培養(yǎng)，所有細胞置于3 7 ℃，5 ％C 0 2 ，濕度充分的恒

3、溫培養(yǎng)箱中。2 ．2 慢病毒的包備與穩(wěn)定株的建立將7 ×1 0 6 個2 9 3 T 細胞分別種于1 0 0 m l T l 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，按照說明書使用L i p f e c t m i n 2 0 0 0 轉染相應的質粒入細胞中( s h R N A 、p P A X 2 和p M D 2 G 各個質粒的轉染比例為4 ：3 ：1 ) ，轉染后6 小時換新鮮培養(yǎng)液，4 8 小時后收集細胞上清，離心過濾后即為病毒懸液。測試

4、病毒滴度后取等量的病毒液置于待感染的細胞，并補等量的培養(yǎng)液培養(yǎng)4 8 小時。根據細胞對p u r o m y c i n 的敏感度采用不同濃度的p u r o m y c i n 篩選1 ～2 周后，R e a l - t i m eP C R 鑒定篩選穩(wěn)定表達株。剩余病毒液分裝后置于．7 0 ℃保存?zhèn)溆谩? ．3 細胞總R N A 提取與R e a l ．t i m e P C R1 x 1 0 6 細胞種于6 孔板中常規(guī)培養(yǎng)過夜。采

5、用R N e a s yM i n i 試劑盒提取總細胞R N A ，紫外分光光度計定量后，取1 鵬總R N A 用無R N A 酶的純凈水補至1 0 山，加入預先配制好的1 0 叫反應的逆轉錄酶混合液中，上機2 5 ℃1 0 m i n 、3 7 ℃1 2 0 m i n 和8 5 ℃1 0 s e c ，將總R N A 逆轉錄生成c D N A 。按T a q m a n 基因表達檢測方法檢測P K D 2 、P K D 3 和R

6、i c t o r 的m R N A 水平。2 ．4 蛋白樣品制備及免疫印跡轉染后4 8 小時或相應處理后按指定時間收集細胞。采用1 ％T r i t o n 裂解液常規(guī)冰上裂解細胞蛋白3 0r a i n ( 2 0m M T r i s - H C l ( p H 7 ．5 ) ，1 5 0m M N a C I ，lm MN a 2 E D l ’A ，l m ME G T ～1 ％T r i t o n , 2 ．5m Ms o

7、 d i u m p y r o p h o s p h a t e ，l m Mb e t a - g l y c e r o p h o s p h a t e ，lm M N a 3 V 0 4 ，l g ／m ll e u p e p t i n ) ，低溫高速離心后檢測蛋白濃度。加入上樣緩沖液的蛋白裂解液加熱至9 5 ℃、5m i n 變性后，取等量的蛋白用M O P S S D S 電泳緩沖液于4 “ - - 1 2 ％B