乙酰肝素酶和SDF-1-CXCR4生物學軸在乳腺癌中的表達及其臨床意義.pdf

1、目的：
　　 乙酰肝素酶（Heparanase，HPSE）是體內(nèi)唯一可以降解細胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（Heparan sulfate proteoglycan，HPSG）一種葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，可促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移?；|(zhì)細胞衍生因子-1（SDF-1）及其受體CXCR4參與許多病理生理過程，包括引起腫瘤細胞產(chǎn)生趨化運動，而腫瘤細胞的趨化運動與腫瘤體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移存在密切關系。細胞外基質(zhì)的降解和腫瘤細胞的定向運動是腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移

2、兩個重要過程，研究顯示乙酰肝素酶高表達與乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關，SDF-1/CXCR4生物學軸的激活在乳腺癌向特定組織器官轉(zhuǎn)移的過程中也起到關鍵作用，但乙酰肝素酶與SDF-1/CXCR4生物學軸在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中是否存在協(xié)同作用尚無人探討。本研究采用免疫組化及RT-PCR方法聯(lián)合檢測乙酰肝素酶、SDF-1、CXCR4在乳腺浸潤癌、導管原位癌、癌旁組織中的表達，旨在明確乙酰肝素酶和SDF-1/CXCR4生物學軸在乳腺癌生長、浸潤、轉(zhuǎn)移中

3、的作用，探討兩者的相關性。
　　 方法：
　　 1、材料
　　 乳腺浸潤癌、乳腺導管原位癌及癌旁組織均取自沈陽醫(yī)學院奉天醫(yī)院2002年9月-2007年12月手術切除標本，其中免疫組化方法檢測標本經(jīng)10％中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，RT-PCR方法檢測標本新鮮組織立即放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 2、免疫組化
　　 免疫組織化學染色采用SP法，將石蠟包埋的組織制成4 μm厚的切片，常規(guī)二甲苯

4、脫蠟，梯度酒精水化；修復抗原；滴加SP法檢測試劑（具體操作按照說明書進行）；乙酰肝素酶、SDF-1和CXCR4抗體均按1:100倍稀釋；PBS代替一抗做陰性對照，已知陽性切片做陽性對照；4℃過夜；AEC顯色5-10min；蘇木素復染；AEC封片膠及中性樹膠封片。
　　 3、RT-PCR
　　 總RNA提取過程嚴格按照RNAiso Plus試劑說明書進行。反轉(zhuǎn)錄過程也按試劑說明書進行操作。循環(huán)條件為：94℃預變性3 min

5、，94℃變性30 s，53.5℃、59.5℃、56.5℃、58.5℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環(huán)后于72℃延伸5 min。PCR反應產(chǎn)物的大小分別是288bp（HPSE）、366 bp（CXCR4）、124 bp（SDF-1）和224 bp（GAPDH），PCR產(chǎn)物經(jīng)EB染色，2％瓊脂糖凝膠電泳，實驗重復三次。采圖并經(jīng)Image J軟件進行灰度定量分析。
　　 4、統(tǒng)計分析
　　 數(shù)據(jù)處理采用SPSS 13

6、.0統(tǒng)計軟件，P<0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、免疫組化
　　 乙酰肝素酶、SDF-1及CXCR4在乳腺浸潤性癌與導管原位癌，導管原位癌與癌旁組織中的表達兩兩比較均有差異（P<0.05），三者在乳腺浸潤性癌中的表達呈正相關（P<0.05），其中乙酰肝素酶和CXCR4表達與乳腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期有關（P<0.05）。
　　 2、RT-PCR
　　 乙酰肝素酶mRNA在乳腺浸潤

7、性癌與導管原位癌，乳腺浸潤癌與癌旁組織中的表達兩兩比較均有差異（P<0.05），導管原位癌與癌旁組織的表達無差異（P>0.05），SDF-1與CXCR4mRNA在乳腺浸潤性癌與導管原位癌，導管原位癌與癌旁組織中的表達兩兩比較均有差異（P<0.05），三者mRNA在乳腺浸潤性癌中的表達呈正相關（P<0.05）
　　 結(jié)論：
　　 乙酰肝素酶和SDF-1/CXCR4生物學軸在促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移過程中均起到重要促