NK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞株體外殺傷作用.pdf

1、目的：探尋經(jīng)免疫磁珠分選純化的原代NK細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)、大量增殖的條件；研究乩A半相合的異基因NK細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤乳腺癌細(xì)胞株的體外殺傷作用，以及NK細(xì)胞表面的NKG2D受體及其相對(duì)應(yīng)的、表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面的mC配體的表達(dá)水平與該腫瘤細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷敏感性之間的關(guān)系。 方法：1．取健康成年人外周血10ml，Hcoll法分離獲取單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)于6孔板，貼壁法去除單核細(xì)胞。使用德國(guó)美天旎公司MACS系統(tǒng)，CD56+Microbead

2、s免疫磁珠分選試劑盒提取高純度NK細(xì)胞。2．將EB病毒株B95—8細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)14天，分別于第7天和第14天收集培養(yǎng)上清。將PBMCs與此含有病毒的上清共培養(yǎng)，并加入環(huán)孢素A(CyA)，至三者的終濃度為：PBMCs為lxl0。／m1，EB病毒為20％，CyA為20ug／ml，培養(yǎng)于96孔板，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每3-4天換液一次，4周后收獲EB病毒轉(zhuǎn)化的B淋巴母細(xì)胞樣細(xì)胞(ENBV-LCLs)，作為NK長(zhǎng)期培養(yǎng)的飼養(yǎng)細(xì)胞。以經(jīng)照射EBV-L

3、CLs作為飼細(xì)胞，在含有IL-15(100u／mL)和中濃度分別為100u/mL和[u／mLIL一2的SCGM(stemcengrowthmedium)中長(zhǎng)期培養(yǎng)NK細(xì)胞。3．取瘤細(xì)胞或者NK細(xì)胞約105個(gè)，堿裂解法抽提DNA，SSP-PCR方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞HLA-Cw位點(diǎn)和NK細(xì)胞KIR位點(diǎn)表達(dá)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，分別將二者分為G1組和G2組(Gl組的HLA-C位點(diǎn)為乩A-Cw2、4、5、6，KIR位點(diǎn)為2DL2／2DL3和2DS2／2D

4、S3；G2組的乩A-C位點(diǎn)為乩A-Cwl、3、7、8，KIR位點(diǎn)為KIR2DU／2DSl)。4．MTT法檢測(cè)乩A-Cw相合與不相合組的NK細(xì)胞對(duì)實(shí)體瘤細(xì)胞的殺傷率，以對(duì)NK細(xì)胞敏感的紅白血病細(xì)胞株K562作為對(duì)照組。5．RT-PCR方法檢測(cè)NK細(xì)胞表達(dá)NKG2D水平，了解其在與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)前后表達(dá)水平的變化，以及乳腺癌細(xì)胞表達(dá)mCA水平與NK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞的殺傷率的關(guān)系。 結(jié)果：1．MACS系統(tǒng)分選出的NK細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀

5、檢測(cè)，CD3-CD56+細(xì)胞的比例(91．1±7．4)％。使用EBV-LCLs作為飼養(yǎng)細(xì)胞，在含IL-2的干細(xì)胞培養(yǎng)液(SCGM)中培養(yǎng)NK細(xì)胞，比較了培養(yǎng)2周、3周、4周的NK細(xì)胞，其殺傷活力與新鮮分離的NK細(xì)胞相比并無(wú)顯著下降：不同濃度IL-2對(duì)NK細(xì)胞增殖d的影響并無(wú)顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2．KIR/HLA-Cw相合組的NK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞株的殺傷率明顯高于KIR/HLA-Cw不相合組，兩組比較差異具有顯著性(p＜0.05)。乳腺癌細(xì)