紫外誘導圓錐鐵線蓮中吲哚生物堿合成機理研究及CtIPT的克隆與原核表達分析.pdf

1、中國是藥用植物資源最豐富的國家之一，而藥用植物在人類疾病預防和治療中占有重要地位。UV-B對藥用植物的生長發(fā)育和次生代謝影響很大，但是，不同藥用植物對UV-B的具體響應情況有所不同，許多機理有待進一步發(fā)現(xiàn)。吲哚生物堿是藥用植物中非常具有研究價值的一類次生代謝產(chǎn)物，在UV-B逆境下含量增加，不僅能夠增強植物自我保護能力以抵御逆境脅迫，還具有細胞毒性、抗癌、抗病毒、抗瘧和抗炎等功效，能夠直接增加植物的藥用價值。細胞分裂素是由腺苷酸異戊烯基轉

2、移酶合成的一類植物激素，在UV-B逆境下含量減少，不僅能夠調控藥用植物生長發(fā)育使其形態(tài)學發(fā)生改變而處于抵御逆境脅迫的狀態(tài)，還可能與UVR8信號通路中的某些調控因子相關，參與調控植物次生代謝產(chǎn)物的合成（如吲哚生物堿、香豆素、黃酮等），能夠間接增加植物的藥用價值。
　　圓錐鐵線蓮屬于毛茛科，具有非常高的藥用價值。實驗室前期從圓錐鐵線蓮中分離出了吲哚生物堿(6-hydroxyl-1H-indol-3-yl) carboxylic aci

3、d methyl ester，本課題在該研究成果的基礎上進行了更深入的研究，主要研究內(nèi)容和結果如下:
　　(1)圓錐鐵線蓮中吲哚生物堿響應UV-B誘導的合成機理
　　HPLC-TOF-MS/MS分析顯示圓錐鐵線蓮經(jīng)過UV-B誘導后其吲哚生物堿(6-hydroxyl-1H-indol-3-yl) carboxylic acid methyl ester含量增加，表明圓錐鐵線蓮在UV-B誘導下體內(nèi)吲哚生物堿合成途徑呈增強狀態(tài)?；?/p>

4、于2-DE和GC-TOF-MS技術的蛋白質組學和代謝組學研究揭示了圓錐鐵線蓮經(jīng)UV-B誘導后吲哚生物堿的合成機理，即與氨基酸代謝相關的蛋白和化合物含量顯著增加，表明氨基酸代謝被激活。
　　通過對絲氨酸脫氨酶進行酶活檢測，結果顯示該酶活經(jīng)過UV-B誘導后顯著增強，表明氨基酸代謝過程被UV-B輻射激活能夠促進下游莽草酸代謝途徑的增強?；趒RT-PCR技術的轉錄組學研究分析了圓錐鐵線蓮經(jīng)UV-B誘導后吲哚生物堿合成途徑上關鍵基因的變化

5、情況，結果顯示從莽草酸到色氨酸代謝過程中的8個關鍵基因的表達表現(xiàn)出上調共性;通過HPLC-TOF-MS/MS代謝組檢測圓錐鐵線蓮經(jīng)UV-B誘導后吲哚生物堿合成途徑上關鍵化合物的變化情況，結果顯示鄰氨基苯甲酸鹽、吲哚和色氨酸的含量都增加;通過對色氨酸合成酶進行酶活檢測，結果顯示該酶活經(jīng)過UV-B誘導后顯著增強，上述結果均表明增強了的莽草酸代謝途徑能夠促進吲哚生物合成途徑的增強，最終為吲哚生物堿的合成奠定了基礎。
　　(2)圓錐鐵線蓮

6、中腺苷酸異戊烯基轉移酶的克隆與原核表達
　　借助轉錄組測序，我們獲得了圓錐鐵線蓮葉片中腺苷酸異戊烯基轉移酶的EST片段，之后利用RT-PCR和cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification ofcDNA ends，RACE)，得到了長度為1374 bp的堿基序列，其中包括長度為332 aa的完整ORF區(qū)。接著對該序列編碼的蛋白CtIPT進行理化性質預測、序列比對和系統(tǒng)進化樹分析，結果顯示該蛋白是一個分子量為37.

7、2 kDa的親水性蛋白，存在腺苷酸異戊烯基轉移酶特征序列區(qū)域(ATP/GTP結合序列區(qū)域)，且與番茄中的SlIPT3/4和擬南芥中的AtIPT3/5/7非常相似，表明該蛋白為腺苷酸異戊烯基轉移酶。然后通過qRT-PCR檢測UV-B誘導對CtIPT表達的影響，結果顯示具有顯著性抑制作用，表明CtIPT可能具有抵御紫外逆境脅迫的功能。再分別以pET-28a(+)、pGEX-4T-1和pMAL-c2X質粒為表達載體對CtIPT進行克隆，并在大