PA28α對食管鱗癌細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響.pdf

1、蛋白酶體是一類多催化位點蛋白酶復(fù)合物，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)大部分蛋白質(zhì)的降解，受著多種復(fù)雜因素的調(diào)控，通過有目的的降解受損傷的或者錯誤折疊的蛋白質(zhì)進(jìn)而調(diào)節(jié)整個細(xì)胞的生命過程，使整個生命過程得以高效準(zhǔn)確地完成，這些過程包括細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫應(yīng)答等[1]。研究顯示，蛋白酶體是一個多亞基蛋白水解復(fù)合物，在生物體內(nèi)最普遍的蛋白酶體形式為26S蛋白酶體，由20S核心顆粒與具有激活核心顆粒作用的蛋白酶體激活因子組成[2]。在蛋白酶

2、體激活因子作用下，蛋白質(zhì)底物進(jìn)入20S核心顆粒的中心水解部位被降解。目前，在生物體內(nèi)主要發(fā)現(xiàn)了兩大類重要的蛋白酶體激活因子，一類蛋白酶體激活因子是19S，又稱PA700。另一類是PA28(proteasomeactivator28)蛋白酶體激活因子家族，又稱11S或REG。11S是由包括PA28α、PA28β和PA28γ三個成員組成[3]。在電鏡下，PA28α是一個環(huán)狀顆粒，無ATP存在時即可與20S結(jié)合，形成PA28α-20S復(fù)合物，

3、可以增大20S核心顆粒與多種底物肽的結(jié)合能力，提高生物體降解蛋白質(zhì)的最大反應(yīng)速度[4]。
　　食管癌是我國北方的惡性腫瘤之一[5]。由于它在早期很難診斷，并且?guī)в泻軓?qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，即使能夠診斷出來，一般也已處于晚期。并且，食管癌的預(yù)后情況差，容易復(fù)發(fā)，確診后的病人5年生存率僅占5～10％[6]。目前治療食管癌的情況并不樂觀，這種不樂觀的情況促使了我們進(jìn)一步了解食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為降低食管鱗癌的發(fā)生率和研發(fā)新的治療食管癌的藥物提

4、供實驗依據(jù)。
　　目前，大量研究發(fā)現(xiàn)多種人類惡性腫瘤中存在PA28異常表達(dá)現(xiàn)象。張林等[7]發(fā)現(xiàn)了PA28α基因能夠抑制胃癌細(xì)胞的生長、增殖，同時還能夠影響其細(xì)胞周期，對抑制胃癌細(xì)胞的惡性表現(xiàn)有一定的意義。Lemaire等[8]采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測到PA28α在正常卵巢上皮中定位和在癌細(xì)胞中定位不同，分別定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)，因此PA28α可以作為卵巢癌的潛在生物學(xué)標(biāo)記。研究顯示，蛋白酶體的其他亞基可以作為腫瘤治療的靶點。有研究

5、表明在乳腺癌中PA28γ有顯著的上調(diào)現(xiàn)象，并且增強(qiáng)了癌細(xì)胞的遷移能力，被作為檢測乳腺癌的一個潛在的生理指標(biāo)[9]。
　　本課題以蛋白酶體激活因子PA28α為研究對象，分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測了它在正常食管上皮細(xì)胞Het-1A和食管鱗癌細(xì)胞株Eca109、EC9706中的表達(dá)以及定位，并且進(jìn)一步研究了PA28α對食管鱗癌細(xì)胞Eca109增殖、凋亡以及遷移能力的影響，為研究PA28α在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能提供了實驗依據(jù)。
　　

6、本課題主要分為兩個部分:
　　第一部分:從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測PA28α在正常食管上皮細(xì)胞Het-1A和食管鱗癌細(xì)胞株Eca109、EC9706中的表達(dá)，分析它們的表達(dá)差異，并且觀察PA28α蛋白在三株細(xì)胞中的定位情況。
　　第二部分:研究PA28α在食管鱗癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展中的作用。首先根據(jù)PA28α在三株細(xì)胞中的表達(dá)差異，設(shè)計沉默PA28α表達(dá)的干擾片段，并對有效干擾片段進(jìn)行篩選。在IFN-γ為陽性對照的情況下，用有效的干

7、擾片段干擾PA28α的表達(dá)，觀察PA28α的表達(dá)情況，并檢測PA28α的沉默表達(dá)對食管鱗癌細(xì)胞Eca109增殖、凋亡和遷移能力的影響。
　　材料和方法
　　1.細(xì)胞株
　　正常食管上皮細(xì)胞Het-1A，食管鱗癌細(xì)胞EC9706、Eca109均為本實驗室保存。三株細(xì)胞均在含有10％胎牛血清的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基中于37℃，含5％CO2的飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2.PA28α在正常食管上皮細(xì)胞(He

8、t-1A)與食管鱗癌細(xì)胞株(Eca109、EC9706)中表達(dá)以其定位
　　利用實時熒光定量PCR和WesternBlot分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測PA28α在Eca109、EC9706和Het-1A三株細(xì)胞中的表達(dá)，并分析它們的表達(dá)差異。細(xì)胞免疫熒光法檢測PA28α蛋白在Eca109、EC9706和Het-1A三株細(xì)胞中的定位。
　　3.siRNA介導(dǎo)的PA28α基因沉默對食管鱗癌細(xì)胞Eca109增殖、凋亡和遷移能力的影

9、響
　　首先利用熒光顯微觀察篩選出最有效的干擾片段，確定最佳干擾濃度，隨后通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法，沉默PA28α蛋白在食管鱗癌細(xì)胞Eca109中的表達(dá)。以轉(zhuǎn)染后24h的食管鱗癌細(xì)胞Eca109為研究對象，以IFN-γ為陽性對照，分別用EdU法和CCK-8法檢測細(xì)胞增殖變化情況，用AnnexinV-FITC/PI雙染法和WesternBlot檢測caspase-3凋亡因子來檢測細(xì)胞凋亡的變化，用Transwell小室實驗和Western

10、Blot檢測對粘附因子E-cadherin的方法檢測細(xì)胞遷移的變化。
　　結(jié)果
　　1.PA28α在正常食管上皮細(xì)胞(Het-1A)與食管鱗癌細(xì)胞株(Eca109、EC9706)中表達(dá)以其定位
　　實時熒光定量PCR和WesternBlot方法檢測結(jié)果表明:與正常食管上皮細(xì)胞Het-1A相比較，PA28α在食管鱗癌細(xì)胞Eca109和EC9706中表達(dá)量明顯增加，尤其是在Eca109細(xì)胞中，結(jié)果與本實驗先前消減雜交結(jié)果一

11、致。細(xì)胞免疫熒光檢測顯示:PA28α蛋白主要定位于食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。
　　2.siRNA介導(dǎo)的PA28α基因沉默對食管鱗癌Eca109細(xì)胞增殖、凋亡和遷移能力的影響
　　與對照組相比，siRNA介導(dǎo)的PA28α的沉默能夠抑制Eca109的增殖能力，并且能夠促進(jìn)其凋亡能力，可能是由于PA28α通過影響蛋白酶體的活性從而改變了Eca109增殖和凋亡能力，表明蛋白酶體在食管鱗癌中起著一定得作用。并且，PA28α的沉默能夠抑制E

12、ca109細(xì)胞的遷移能力和粘附因子E-cadherin的表達(dá)。
　　結(jié)論
　　1.與正常食管上皮細(xì)胞相比，PA28α在食管鱗癌細(xì)胞Eca109和EC9706中有高表達(dá)現(xiàn)象，并且在Eca109尤為明顯，這可能與食管鱗癌細(xì)胞Eca109和EC9706的分化程度不同有關(guān)。
　　2.PA28α主要定位在食管鱗癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)部分。
　　3.siRNA介導(dǎo)的PA28α沉默能夠在一定程度上抑制Eca109的增殖能力，并且能夠增