ARB在壓力超負荷引起的心肌肥大的作用及機制的研究.pdf

1、多年來的基礎和臨床研究顯示,心臟肥大不僅是心臟對各種刺激的代償反應,而且是許多心血管疾病發(fā)病及死亡的獨立危險因素。在許多內在和外在的誘發(fā)心臟肥大的因素中,壓力超負荷是最重要的激發(fā)因素,因此確定壓力超負荷所導致的心臟肥大的分子機制非常重要,其中血管緊張素Ⅱ受體(AT1)的活化在心臟肥大中的作用在近年來備受矚目。越來越多的證據表明血管緊張素Ⅱ型受體拮抗劑(ARB)在降低病人血壓的同時,還能夠保護靶器官并降低心血管事件的發(fā)病率和死亡率。當前許

2、多ARB在臨床實踐中得到廣泛運用,如氯沙坦,厄貝沙坦,替米沙坦,坎地沙坦,奧米沙坦和纈沙坦等。雖然有研究認為一些ARB在降低血壓方面要優(yōu)于一些其他的抗高血壓藥物,如β受體阻滯劑和鈣離子通道拮抗劑,也有一些報道認為ARB和其他的抗高血壓藥物在靶器官保護中有不同的作用。由此我們假設不同的ARB除降壓之外,它們在機械牽張導致心肌肥大中的作用和機制也有可能不同。
　　AT1受體屬于G蛋白偶聯受體家族,ARB高度選擇性的結合于AT1受體并因

3、此阻斷AT1受體介導的各種效應。從結構上看,各種ARB除了有一個共同的母核一聯苯四唑環(huán)外,還有一個在該環(huán)上特異的側鏈基團,這可能是導致它們之間藥效和藥物代謝不同的最主要的原因。包括我們在內許多離體研究提示不同ARB抑制AT1受體活化的作用和機制都有所不同,但目前為止還沒有報道比較不同ARB在壓力超負荷下導致的心臟肥厚中的作用。我們最近報道坎地沙坦能夠不依賴AngⅡ直接抑制機械牽張引起的心肌肥大,但其他的ARB是不是有同樣的作用以及它們抑

4、制機械牽張觸發(fā)的心肌肥大的分子機制還少見報道。
　　我們的結果提示不同的ARB在壓力超負荷下對心肌的保護是不一樣的,這與他們的化學結構差異密切相關。因此,確定機械牽張條件下的ARB的化學結構和AT1受體的相互作用模型以及AT1受體活化的分子機制有助于我們進一步理解機械牽張觸發(fā)的心肌細胞信號傳導通路,基于抑制AT1受體活化的方式的不同來區(qū)別ARB以及開發(fā)出既能降壓又能很好的靶器官保護的新型ARB。此外,心臟肥厚是心力衰竭的獨立危險因

5、素,確定心臟肥大的分子機制有利于我們進一步預防和治療心衰。因此,結合先前的研究結果,我們就機械牽張導致的心肌肥大的分子機制以及不同ARB在該過程中的不同作用做些探討。
　　第一部分不同ARB逆轉壓力超負荷誘導的小鼠心臟肥厚的差異比較
　　目的:比較五種ARB(氯沙坦,替米沙坦,坎地沙坦,奧米沙坦和纈沙坦)對壓力超負荷導致的心臟肥厚的作用強度和作用方式的差異。
　　方法:縮窄小鼠主動脈弓(TAC)作為小鼠壓力超負荷心臟腮

6、大模型。10周齡野生型和血管緊張素原基因敲除小鼠隨機各分為7個組:sham組(sham,n=5和n=4),生理鹽水組加TAC組(saline,n=9和n=8),奧美沙坦組加TAC組(olmesartan,n=10和n=9),坎地沙坦加TAC組(condesartan,n=10和n=8),氯沙坦加TAC組(losartan,n=8和n=8),替米沙坦加TAC組(telmisartan,n=10和n=8)和纈沙坦加TAC組(valsarta

7、n,n=9和n=8)。在TAC2周后,米勒導管經右頸總動脈行至左心室測得左心室壓力。五個指標用于評價TAC2周后心臟腮大和重構程度:
　　1、行小動物高頻超聲檢查心臟心態(tài)學和評價心臟功能。
　　2、心重體重比用于比較心臟大小。
　　3、通過RT-PCR檢測肥大基因心房利鈉肽(ANP),a-骨骼肌肌動蛋白(SAA)和肌漿網ATP鈣泵(SERCA2),并通過Real-timePCR進一步驗證。
　　4、病理切片染色用

8、于顯示心臟橫切面大小(ESA),心肌細胞橫切面積大小(CSA)和心肌纖維化程度。
　　結果:僅僅左心室收縮末壓(LVSP)大于155mmHg且小于180mmHg的小鼠用于統計分析,在各組行TAC手術中的小鼠的LVSP無統計學差異。對于野生型小鼠,五種ARB均能逆轉壓力超負荷引發(fā)的心臟肥厚。但對于ATGKO的小鼠纈沙坦和替米沙坦不能抑制TAC導致的心臟肥大的發(fā)展而氯沙坦,坎地沙坦和奧米沙坦仍然可以。
　　結論:我們的數據提示氯

9、沙坦,坎地沙坦和奧米沙坦不依賴AngⅡ而纈沙坦和替米沙坦依賴AngⅡ逆轉壓力超負荷導致的心肌肥大。
　　第二部分不同ARB在機械牽張觸發(fā)的Jak2信號通路中的作用
　　目的:通過比較奧米沙坦和替米沙坦對機械牽張觸發(fā)的心肌細胞肥大的抑制效應來探討機械牽張觸發(fā)的Jak2信號通路。
　　方法:
　　(1)從四個化學合成的siRNA中篩選能有效干擾血管緊張素原(ATG)siRNA片段,將差速貼壁法分離得到的新生大鼠乳鼠心

10、肌細胞分為五組:分別為陽性對照組(轉染陰性siRNA)和轉染四種針對血管緊張素原siRNA片段;用Real-time PCR方法檢測ATG來確定五個siRNA片段干擾效率,從中篩選出一個干擾效果最好的片段用于后繼實驗。
　　(2)新生大鼠乳鼠心肌細胞分為兩大組:野生型組(不轉染siRNA)和siRNA干擾組;野生型組再分成四小組分別為空白對照組(不牽張),牽張組,Olmesartan組(Olmesartan加牽張),Temisar

11、tan組(Temisartan加牽張);siRNA干擾組同樣分為空白對照組(轉染siRNA不牽張),牽張組(轉染siRNA并牽張),Olmesartan組轉染(Olmesartan加siRNA并牽張),Temisartan組(Temisartan加siRNA并牽張)。通過Real-time PCR檢測即刻早期反應基因c-fos,c-jun和心室利鈉肽(BNP)在各組中的表達量。Western bloting檢測AT1,Gαq11,p-E

12、RKs,Jak2,p-Jak2的各組蛋白的表達量。
　　結果:
　　(1)相比陰性對照siRNA片段,四個化學合成siRNA片段都能不同程度的降低ATG的表達,其中第三個片段干擾效率最高。
　　(2)對于野生型組,Olmesartan和Telmisartan都能夠顯著抑制因牽張引起c-fos,c-jun和BNP的表達:牽張后Gαq11在心肌細胞胞漿中含量明顯升高,Olmesartan和Telmisartan都能夠顯著抑

13、制Gaq11在胞漿中的升高;牽張后,與AT1受體結合的JaK2量顯著增加,Olmesartan和Telmisartan能顯著抑制AT1和JaK2的結合;Olmesartan和Telmisartan都能夠顯著抑制因牽張引起p-ERKs的表達。對于siRNA干擾組,相對Telmisartan,Olmesartan能夠顯著抑制因牽張引起c-fos和c-jun的表達量的增加,Gαq11在心肌細胞胞漿中含量的升高以及與AT1受體結合的JaK2量和

14、p-ERKs表達量的增加。
　　結論:機械牽張能夠不依賴AngⅡ通過AT1-JaK2-ERKs信號途徑直接引起心肌細胞肥大,Olmesartan而不是Telmisartan能有效阻斷該信號通路。
　　第三部分CaMKⅡ參與機械牽張直接激活AT1受體下游的信號通路
　　目的:初步探討CaMKⅡ在機械牽張導致的AT1受體活化的信號通路中的作用并進一步明確CaMKⅡ的那個結構域參與這一重要信號通路。
　　方法:

15、　　(1)對培養(yǎng)在硅膠皿中的心肌細胞轉染siRNA后,分別用AT1受體的拮抗劑奧米沙坦和CaMKⅡ的特異性抑制劑KN-93處理并牽張,用WB檢測CaMKⅡ和p-ERK的表達。
　　(2)將接種于硅膠皿的HEK293AT1細胞分為四個大組,分別為轉染CaMKⅡδB組;轉染CaMKⅡδC組;轉染CaMKⅡδN組;轉染CaMKⅡδM組。這四個大組再亞分為不牽張和牽張兩小組。牽張10分鐘后檢測的p-ERKs的表達。
　　結果:

16、>　　(1)在心肌細胞中,在沒有AngⅡ的情況下,相對于不牽張組,機械牽張可明顯升高CaMKⅡ的表達;奧米沙坦能明顯抑制機械牽張導致CaMKⅡ的表達升高;KN-93和奧米沙坦通過分別抑制CaMKⅡ和AT1受體明顯降低機械牽張導致的ERK的磷酸化。
　　(2)相對于各自的未牽張組,轉染CaMKⅡδC,CaMKⅡδN,CaMKⅡB質粒的HEK293AT1細胞牽張后p-ERKs明顯上升,但轉染CaMKⅡδM質粒的HEK293AT1細胞牽

17、張后p-ERKs不見升高。
　　結論:機械牽張能夠不依賴AngⅡ直接觸發(fā)AT1-CaMKⅡ-ERKs信號途徑,位于CaMKⅡ中部的自我調節(jié)域可能是參與這一通路的關鍵結構域。
　　結論：
　　1.建立了升主動脈縮窄的壓力超負荷小鼠心肌月巴大模型。
　　2.氯沙坦,坎地沙坦和奧米沙坦不依賴AngⅡ而纈沙坦和替米沙坦依賴AngⅡ逆轉壓力超負荷導致的小鼠心臟胃巴大。
　　3.機械牽張能夠不依賴AngⅡ通過AT1-J

18、aK2-ERKs信號途徑直接弓}起心肌細胞肥大,Olmesartan而不是Telmisartan能有效阻斷該信號通路。
　　4.機械牽張能夠不依賴AngⅡ直接觸發(fā)AT1-CaMKⅡ-ERKs信號途徑,位于CaMKⅡ中部的自我調節(jié)域可能是參與這一通路的關鍵結構域。
　　潛在價值和創(chuàng)新點：
　　1.能夠為以后進行藥物心臟保護實驗提供穩(wěn)定可靠的小鼠心臟肥厚模型。
　　2.發(fā)現并初步證實了在心肌細胞中機械牽張能導致JaK