EGFR受體介導肺腫瘤靶向siRNA脂多胺修飾脂質體的制備與評價.pdf

1、目的:旨在構建EGFR靶向負載Survivin-siRNA的Staramine修飾的陽離子脂質體(EGFR-PEG-SCLs-siRNA),對其進行制劑學評價,考察其細胞毒性、靶向性、體外攝取、攝取機制以及體外藥效學評價,并篩選出沉默效率最高的siRNA鏈等前期工作,為后續(xù)制成干粉吸入劑用于肺部給藥、發(fā)揮藥效提供實驗依據。
　　方法:本文通過油酰氯成酯后,發(fā)生酰胺反應得到類脂質載體Staramine。另外,在納米載體外,進行PEG

2、修飾,最后通過TLC、1H-NMR、FT-IR等手段對各產物進行結構表征。Western blot法篩選出最高沉默效率的Survivin-siRNA鏈。采用乙醇注入法制備脂質體,靜電吸附負載siRNA。通過對其粒徑、Zeta電位、包封率、抗RNase酶穩(wěn)定性的評價對脂質體進行表征和評價。體外評價以高表達Survivin的人源性肺腺癌耐順鉑株A549/DDP細胞為模型,以MTT法評價載體安全性,原子力顯微鏡觀察細胞對脂質體的攝取作用。以市

3、售制劑Lipofectamine-2000作為陽性對照,采用流式細胞儀考察脂質體的攝取,攝取機制,以及細胞凋亡實驗用于評價體外藥效。
　　結果:類脂質載體Staramine經TLC、FT-IR、1H-NMR等手段驗證產物合成,經1H-NMR計算純度為87％,DSPE-PEG2000-Mal經TLC和1H-NMR手段驗證產物合成,經1H-NMR計算純度為86.2％。Western blot法篩選出最高沉默效率為38.40％的Surv

4、ivin-siRNA鏈的。所制備的Staramine修飾的陽離子脂質體平均粒徑為(172.7±6.6)nm、Zeta-電位為(+7.78±0.5)mV、包封率為(90.8±0.8)％,粒度均一,且對RNase酶有較好的保護作用。原子力顯微鏡觀察A549/DDP細胞通過內吞作用攝取脂質體,流式細胞儀結果表明,EGFR靶向顯著性(p<0.05)提高細胞攝取,其平均熒光強度是EGFR未修飾的1.4倍。攝取機制結果表明,細胞攝取脂質體是一個能量

5、依賴的過程,主要通過網格蛋白以及小窩蛋白介導的內吞。細胞凋亡的實驗結果表明,EGFR-PEG-SCLs-siRNA組的凋亡率為(41.19±1.83)％,明顯高于Lipofectamine-2000組的(21.03±1.37)％。
　　結論:本文制備的EGFR靶向負載Survivin-siRNA的Staramine修飾的陽離子脂質體(EGFR-PEG-SCLs-siRNA)粒徑均一穩(wěn)定,EGFR靶向顯著提高細胞攝取率。網格蛋白和小