Cajal間質細胞培養(yǎng)、傳代及胃動素受體的表達.pdf

1、實驗背景：
　　ICC是廣泛分布于胃腸道平滑肌和神經叢的一類特殊類型間質細胞。研究證實其主要功能有[1,2]：1、胃腸道慢波活動的起搏細胞；2、促進電活動的傳導；3、介導胃腸神經和平滑肌之間信號傳導；4、作為牽張感受器協調機械壓力的輸入。
　　許多胃腸動力障礙性疾病與ICC的異常變化有關。因此，在胃腸道把ICC作為治療和研究的靶目標很有現實意義。但是體外分離和培養(yǎng)ICC仍存在許多不確定因素，尤其是長期培養(yǎng)ICC的可行性及IC

2、C的生物學特性等問題仍然不能解釋清楚。有關ICC的培養(yǎng)、傳代、凍存及復蘇也未見報道，因此摸索ICC長期培養(yǎng)的條件，了解細胞生物學特性，為持續(xù)性研究ICC功能打下基礎。
　　近來研究顯示在ICC上已經發(fā)現了十余種類型的受體,包括：膽囊收縮素受體A[3]、G蛋白偶聯受體（PKA,PKC）[4]、膽堿能（M2,M3）受體[5]、神經激肽（NK1,NK3）受體[6]、嘌呤能（P2Y1,P2Y4,P2X2,P2X5）受體[7,8]、五羥色胺

3、(5-HT,5-HT3,5-HT4)受體[9,10]等。受體的研究對詮釋細胞功能及新型藥物研發(fā)有重要的指導意義。
　　胃動素是由22個氨基酸組成的單鏈腦腸肽，主要由十二指腸和空腸黏膜上皮Mo內分泌細胞分泌。其生理作用是來調節(jié)胃腸移行性運動復合波(MMC)。而胃動素調節(jié)胃腸活動的機制一個重要突破口就是胃動素受體的分布及受體后信號通路的研究。根據目前報道胃動素受體在不同物種的胃腸平滑肌細胞和腸神經元均有表達[11,12,13,14,1

4、5,16,17,18]。而作為胃腸功能單位“神經-ICC-平滑肌”網絡中ICC是否會存在胃動素受體表達？我們先前的關于ICC在胃動素受體激動劑誘導平滑肌收縮中作用機制的研究顯示ICC可能存在胃動素受體表達[19]。
　　實驗目的：
　　本研究目的就是探討ICC的培養(yǎng)、凍存與復蘇、傳代的條件，了解細胞的生物學特性；分別從細胞形態(tài)學、基因和蛋白水平來驗證ICC上是否存在胃動素受體的表達。
　　實驗方法：
　　第一部分

5、：以兔小腸為ICC組織來源，應用膠原酶消化法分離、培養(yǎng)ICC；特異的c-kit抗體對ICC進行免疫熒光鑒定；對細胞進行傳代培養(yǎng)；摸索細胞凍存和復蘇的條件；用MTT法測定傳代后細胞生長曲線。
　　第二部分：新鮮分離的細胞和培養(yǎng)15天的細胞分別進行流式細胞分析c-kit陽性細胞比率，選用陽性率高的方法進行ICC的分選；以流式細胞儀分選的ICC為靶細胞，分別采用反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和蛋白免疫印跡（Westernblot）

6、技術。將提取的細胞總RNA和總蛋白，進行分析檢測；應用特異性c-kit蛋白抗體、胃動素受體抗體(anti-GPR38)以及細胞核染料（hoechst33342）對培養(yǎng)的細胞進行免疫熒光染色；從基因和蛋白水平以及細胞形態(tài)方面來驗證ICC是否表達胃動素受體。
　　實驗結果：
　　1、普通光鏡和免疫熒光分析證實成功分離、培養(yǎng)ICC；細胞傳代達數次，且生長狀態(tài)良好；對數生長期的ICC經凍存后復蘇成功；成功繪制出細胞生長曲線。

7、　　2、比較新鮮分離的細胞和培養(yǎng)數日的細胞流式分析結果，c-kit陽性細胞比率。前者為9.8％，后者為19.1％。培養(yǎng)的細胞經流式分析的陽性細胞比率高；選用培養(yǎng)的細胞進行流式分選作為細胞來源。再次流式分析培養(yǎng)的細胞中c-kit陽性細胞比率為64.3％，分選出陽性細胞分別為6.7×105個和5.6×106個；分別對提取ICC的總RNA和總蛋白分析檢測顯示胃動素受體mRNA以及受體蛋白定性分析結果均為陽性；細胞免疫熒光三標實驗顯示ICC胞膜