釀酒酵母Ras2蛋白的功能研究.pdf

1、RAS基因家族廣泛存在于包括酵母、果蠅及哺乳動物在內的真核細胞中。由于Ras基因與人類惡性腫瘤的產生極為相關,所以受到極大的關注。酵母Ras蛋白參與cAMP信號轉導,并由于其與多細胞生物Ras蛋白的高度保守性而被廣泛深入的研究。本論文的主要研究內容是探討釀酒酵母Ras2蛋白在Ras/cAMP/PKA的反饋抑制調控中的作用。同時,還對PKA活性與Ras2蛋白的膜定位及酵母細胞保持質粒的能力的關系進行了研究。
　　 實驗結果表明,帶

2、有顯性突變RMS2Val19質粒的酵母細胞經熱擊后發(fā)生質粒丟失現象。這種質粒丟失現象與帶有該質粒的酵母細胞中的高PKA活性相關。這可能是由于熱擊改變了細胞膜的通透性而使質粒溢出,或者由于細胞響應熱擊使HSE元件激活并誘導某種酶的表達或者活化,將非染色體形式存在的質粒降解。
　　 釀酒酵母細胞中Ras2蛋白磷酸化位點的突變缺失使得受試菌株對熱擊更加敏感,胞內貯存糖原的含量降低,細胞穩(wěn)態(tài)cAMP水平及誘導的水平都較野生型細胞更高。實

3、驗表明,Ras2Ala214蛋白結合GTP能力較野生型高,與其共Pulldown的Cdc25蛋白水平也較野生型高,Ras2-GTP水平與PKA活性負相關,表明釀酒酵母PKA對cAMP通路的反饋抑制作用的機制之一是通過對Ras2蛋白的磷酸化修飾來實現的。磷酸化修飾作用對Ras2蛋白的細胞定位沒有可分辨的影響,而PKA活性的變化對Ras2蛋白的細胞定位有影響。上述結果表明,PKA對Ras2的磷酸化作用減弱Ras2與GTP的結合能力從而降低R

4、as2對腺苷酸環(huán)化酶的激活作用,反饋抑制Ras-cAMP通路。實驗結果還表明,Cdc25p與Ras2-GTP有較強的結合能力。
　　 在甘油培養(yǎng)條件下野生型菌株胞內Ras2-GTP及與之結合的Cdc25p水平較葡萄糖培養(yǎng)條件下高,SCH9缺失則降低Ras2-GTP水平,表明在甘油培養(yǎng)條件下,SCH9抑制PKA活性,這與其在葡萄糖存在的完全培養(yǎng)條件下作用相反。
　　 兩個不同的Ras蛋白對該信號通路的影響不同,Ras2蛋白