HuR介導IL-1β增加NSCLC細胞VEGF-C mRNA穩(wěn)定性的分子機制.pdf

1、研究背景： 腫瘤擴散的重要機制之一是腫瘤細胞離開原發(fā)部位，通過淋巴系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)。近年研究證實，腫瘤誘導的淋巴管生成促進了癌細胞的轉(zhuǎn)移性擴散，導致腫瘤患者預后差、生存率低。多項研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)-c和-D是最重要的兩個淋巴管生成因子，它們通過結(jié)合淋巴管內(nèi)皮細胞(LEC)上的血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)-3，繼而促進LEC增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成，從而誘導淋巴管生成。 大量臨床病理研究證實，在多種

2、人類腫瘤中，如非小細胞肺癌(NSCLC)、乳腺癌、結(jié)腸癌等實體腫瘤，VEGF-C表達與微淋巴管密度(LMVD)、淋巴管侵襲(LVI)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。多種化學誘導的腫瘤模型、轉(zhuǎn)基因模型和移植瘤模型實驗證實VEGF-C過表達可促進腫瘤淋巴管生成、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甚至遠處轉(zhuǎn)移。因此，深入探討VEGF-C表達調(diào)控，以抑制VEGF-C表達，阻斷淋巴管生成，最終改善惡性腫瘤患者的預后，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用前景。與VEGF-A相似，多種炎

3、癥信號和分子如低氧、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、促炎細胞因子白介素1-β(I1-β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等通過自分泌和旁分泌的機制上調(diào)VEGF-CmRNA和蛋白在不同類型細胞中的表達。然而，既往的研究多局限于核因子-κB(NF-κB)等轉(zhuǎn)錄水平對VEGF-C的調(diào)控，對其在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控尤其是在腫瘤細胞中的調(diào)控和機制尚不清楚。 人抗原R(HuR)是胚胎致死視覺異常(ELAV)家族的RNA結(jié)合蛋白，最初發(fā)現(xiàn)HuR與神經(jīng)

4、分化有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)HuR是調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性的重要RNA結(jié)合蛋白。研究證實，在細胞外信號的作用如炎癥因子、激素和生長因子等刺激下，HuR可在細胞核和細胞漿之間穿梭，導致胞漿中的HuR蛋白量增高，并通過RNA識別基序(RRM)與多種mRNA3’端未翻譯區(qū)(3’UTR)的富含AU堿基的序列(ARE)結(jié)合，使mRNA從胞核轉(zhuǎn)運至胞漿的過程中保護mRNA免受核酸酶降解，從而增加mRNA的穩(wěn)定性。多種分子的mRNA，如介導細胞增殖的細胞周期蛋

5、白cyclinA、cyclinB，細胞因子TNF-α、IL-6和IL-8，以及VEGF-A和COX-2的mRNA含有ARE，均受ARE結(jié)合蛋白調(diào)控(AUBP)，包括增加mRNA穩(wěn)定性的HuR和促進mRNA降解的AU結(jié)合因子-1(AUF-1)。但HuR是否也調(diào)控了VEGF-C表達，目前尚不清楚。 體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，HuR不僅在多種人類腫瘤組織和細胞中高表達，而且證實胞漿HuR陽性而不是胞核HuR陽性與乳腺癌和直腸癌等預后相關(guān)。但目前

6、尚未見HuR與肺癌關(guān)系的報告。最近研究發(fā)現(xiàn)，胞漿HuR陽性并與乳腺癌ER陰性、PR陰性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些研究提示HuR可能參與了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程，但具體機制尚不清楚。 目的： 研究HuR與VEGF-C表達在肺癌中的關(guān)系，并進一步探討HuR調(diào)控VEGF-CmRNA穩(wěn)定性的分子機制，為尋找新的抗腫瘤淋巴管生成分子靶點提供實驗依據(jù)。 方法： 1.免疫組織化學法檢測HuR和VEGF-C蛋白在81例NSCLC

7、組織和15例肺良性病變組織中的表達，并分析腫瘤胞漿、胞核HuR表達分別與VEGF-C表達、腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的關(guān)系。 2.以Lewis肺癌(LLC)細胞為主要體外模型，應(yīng)用Westernblotting、定量RT-PCR和ELISA方法檢測IL-1β刺激LLC細胞表達VEGF-C蛋白和mRNA的時間和劑量效應(yīng)關(guān)系。 3.利用放線菌素D(ActD)脈沖追蹤實驗觀察IL-1β上調(diào)VEGF-C表達是否與其mRNA

8、穩(wěn)定性增加有關(guān)。 4.構(gòu)建HuR干擾載體pGenesil-siHuR，通過siRNA干擾HuR表達，以明確HuR在IL-1β增加LLC細胞VEGF-CmRNA穩(wěn)定性中的作用。 5.構(gòu)建HuR真核表達載體，體外分析高HuR水平對IL-1β刺激LLC細胞表達VEGF-C的影響。 6.MTT實驗和Transwell實驗分別分析HuR過表達對IL-1β誘導LLC細胞生長和遷移的影響。 7.用C57BL/6小鼠，建

9、立高表達HuR和非高表達HuR的LLC皮下移植瘤模型；分析高HuR水平對移植瘤生長、VEGF-C表達、淋巴管生成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移的影響。 8.Westernblotting和定量RT-PCR分別檢測高表達HuR的LLC移植瘤、對照組移植瘤VEGF-C蛋白和mRNA的表達情況。 9.利用免疫熒光和共聚焦顯微鏡觀察IL-1β刺激肺腺癌細胞后HuR蛋白在胞核-胞漿的轉(zhuǎn)運，并進一步分析p38MAPK通路在調(diào)控HuR轉(zhuǎn)運中的作

10、用。 10.構(gòu)建熒光素酶報告基因載體，通過雙熒光報告基因檢測試劑盒、RT-PCR分析含有ARE的VEGF-C3’UTR在調(diào)控mRNA穩(wěn)定性中的作用，并進一步分析不同ARE區(qū)域調(diào)控mRNA穩(wěn)定性的差異。 結(jié)果: 1.81例NSCLC的HuR胞漿陽性表達率、HuR胞核陽性表達率、VEGF-C陽性表達率分別為45.7％(37/81)、82.7％(67/81)和70.4％(57/81)，與肺良性病變組織比較均有顯著性差異

11、(P＜0.01)。VEGF-C表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.01)和NSCLC臨床分期密切相關(guān)(P＜0.01)，但與患者性別、年齡、組織學類型和組織分化程度均不相關(guān)(P＞0.05)。胞漿HuR表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.01)、分化程度(P＜0.05)和pTNM分期密切相關(guān)(P＜0.05)，但與患者的性別、年齡和肺癌組織學類型無明顯關(guān)系(P＞0.05)。胞漿HuR高表達(P＜0.05)而不是胞核HuR高表達(P＞0.05)與VEGF-C的

12、表達呈正相關(guān)。 2.隨著IL-1β濃度(0-20mg/ml)增加，LLC細胞胞漿VEGF-C蛋白和mRNA以及分泌的VEGF-C水平顯著上調(diào)，刺激后12h達最高值。 3.IL-1β誘導VEGF-C表達與VEGF-CmRNA穩(wěn)定性增加密切相關(guān)。 4.成功構(gòu)建了pGenesil-siHuR干擾載體；載體轉(zhuǎn)染LLC細胞下調(diào)了HuR表達，繼而阻斷了IL-1β誘導的VEGF-C表達并降低了VEGF-CmRNA穩(wěn)定性。

13、 5.成功構(gòu)建了HuR真核表達質(zhì)粒pEGFP-HuR；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LLC細胞增加了IL-1β誘導的VEGF-C表達。 6.Transwell和MTT實驗結(jié)果顯示，HuR過表達增加了LLC細胞遷移，促進了細胞生長。 7.動物實驗分為pEGFP-N1/LLC組和pEGFP-HuR/LLC組。小鼠皮下移植LLC后30d，比較pEGFP-N1對照組(n=6)同側(cè)頸上、對側(cè)頸上及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為分別為100％、83.3％和33.3

14、％，而pEGFP-HuR組分別為100％、66.7％和100％。同側(cè)頸上和對側(cè)頸上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率兩組間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，但pEGFP-HuR組腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯高于對照組(P＜0.05)，分別為100％和33.3％。兩組雙肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)分別為(6.5±2.1)和(10.7±2.4)，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。HuR過表達組移植瘤LMVD為19.7±2.4，顯著高于對照組(13.2±2.8)(P＜0.05)。 8.

15、Westernblotting和定量RT-PCR結(jié)果顯示HuR過表達的LLC移植瘤VEGF-C蛋白和mRNA水平顯著高于對照組。 9.免疫熒光和共聚焦顯微鏡及Westernblotting結(jié)果顯示，IL-1β增加了HuR蛋白在胞漿中的聚集。 10.p38MAPK特異性抑制劑SB352038阻斷了IL-1β誘導的HuR胞核-胞漿轉(zhuǎn)運和VEGF-C表達，并降低了VEGF-CmRNA的穩(wěn)定性和VEGF-C表達。 11.

16、成功構(gòu)建了熒光素酶報告載體pGL3-VEGF-C3’UTR、pGL3-VEGF-C3’UTR1、pGL3-VEGF-C3’UTR2和對照載體pGL3-VEGF-CCR。 12.定量RT-PCR和雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果表明，與pGL3-VEGF-CCR轉(zhuǎn)染組比較，pGL3-VEGF-C3’UTR轉(zhuǎn)染組熒光素酶mRNA水平和熒光素酶活性顯著降低。進一步發(fā)現(xiàn)pGL3-VEGF-C3’UTR2轉(zhuǎn)染組熒光素酶mRNA水平和熒光素酶活性