GRAVES病小鼠模型及甲狀腺相關眼病的研究.pdf

1、背景及目的： Graves病(Graves'disease，GD)是常見的器官特異性自身免疫疾病，其發(fā)生的直接原因是機體產(chǎn)生了針對促甲狀腺素(TSH)受體(TSHR)的刺激性抗體(TSAb)，從而促進甲狀腺素的生成。目前GD的具體發(fā)病機制尚不明確，傳統(tǒng)的治療方法不能從根源上阻斷疾病的發(fā)生。而建立GD動物模型無疑是解決上述問題的有效手段。近十余年，人們通過不同方法用TSHR抗原主動免疫動物產(chǎn)生TSHR抗體(TRAb)，成功建立了

2、甲亢小鼠模型，但是這些建模方法在發(fā)病率，發(fā)病穩(wěn)定性，易感小鼠種系以及臨床表現(xiàn)上都存在較大差別。其中，用表達TSHR A亞單位的腺病毒(Ad-TSHR-A)免疫雌性BALB/c小鼠建立GD模型是比較穩(wěn)定且成模率較高的造模方法。因此，本研究第一部分利用Ad-TSHR-A免疫BALB/c小鼠建立GD模型，并在此基礎上進行GD免疫機制和新治療方法的探討。 GD可以出現(xiàn)甲狀腺外的器官損害，其中最常見的是甲狀腺相關眼病(TAO)，占GD患

3、者的25-50％。目前TAO的治療方法主要是激素和球后放療，激素治療方案之間差別很大，而球后放療仍然存在爭議。疾病活動度和嚴重程度決定TAO治療時機的選擇，因此，了解TAO嚴重程度的影響因素對我們正確評判疾病的進展和選擇治療時機很有幫助。同時，GD和TAO是多基因疾病，遺傳因素和環(huán)境因素在發(fā)病中起著重要作用，一些基因多態(tài)性已被證實和GD/TAO的發(fā)病有關。本研究第二部分通過對TAO患者的臨床資料進行分析，以了解TAO嚴重程度的影響因素和

4、進行不同治療方法的比較，并對干擾素誘導的解螺旋酶(Interferon-induced helicase，IFIH1)基因多態(tài)性和GD/TAO的相關性進行探討。 研究方法： 1.應用Ad-TSHR-A肌注免疫雌性BALB/c小鼠，誘導TRAb生成，進而建立GD小鼠模型，并在該模型的基礎上進行以下研究：1)應用合成的T細胞抗原肽刺激小鼠脾臟單個核細胞探討GD小鼠中Th1/Th2免疫反應狀態(tài)；2)采用移植致敏淋巴細胞的方法以

5、期建立TAO的小鼠模型。3)通過鼻粘膜給予T細胞表位肽的方法誘導粘膜耐受以期改善GD病情。4)口服靈芝多糖對GD小鼠模型的影響及機制的探討。 2.對2003年2008年瑞金醫(yī)院就診的TAO患者的臨床資料進行回顧性分析，了解TAO嚴重程度的影響因素；對接受激素和球后放療的患者進行隨訪觀察，以對比不同治療方案的療效，并分析影響療效的因素。同時采用單堿基延伸的方法對IFIH1基因A946T位點單核苷酸多態(tài)性(single nucleo

6、tide polymorphism，SNP)和GD/TAO的相關性進行探討。 結果： 1.本研究運用Ad-TSHR-A免疫雌性BALB/c小鼠成功建立了GD小鼠模型，甲亢小鼠表現(xiàn)為血清T4和TRAb增高，小鼠在第三次免疫后4周，低免疫劑量組和高免疫劑量組分別有5/6只和4/6只小鼠發(fā)生了甲亢。甲亢小鼠出現(xiàn)肝臟損害，且血清ALT，ALP和血清T4水平呈正相關。眼病的發(fā)生率很低，42只免疫小鼠中僅有2只出現(xiàn)了眼部的改變。

7、 利用合成的T細胞表位肽(PA多肽)刺激Ad-TSHR-A免疫小鼠的脾臟淋巴細胞，結果IFN-γ生成明顯增高，而IL-4沒有明顯改變，提示該建模方法中Th1免疫反應可能發(fā)揮重要作用。移植GD小鼠的脾臟細胞，受體小鼠沒有發(fā)生血清T4和TRAb的改變，也無TAO的發(fā)生。通過鼻粘膜預先用PA多肽免疫小鼠，結果抗原特異性淋巴細胞反應中，IFN-γ生成減少，但是GD小鼠血清T4和TRAb都沒有明顯改變。 高劑量靈芝多糖干預下， GD小

8、鼠的血清T4和TRAb水平都有增高，但是沒有達到統(tǒng)計學差異(PT4=0.065，PTRAb=0.052)。高劑量靈芝多糖可以增加免疫小鼠的抗原特異性淋巴細胞反應中IFN-γ生成，同時促進小鼠脾臟貼壁細胞生成IL-12，提示靈芝多糖可以促進Th1，特別是抗原特異性Th1免疫反應。靈芝多糖干預下，小鼠肝酶指標下降。 2.TAO患者資料分析中，發(fā)病年齡大，吸煙的患者眼病病情更為嚴重；有家族史的患者發(fā)病年齡明顯小于無家族史者。在治療方法

9、的比較中，靜脈甲強龍的療效最高，而球后放療療效最差，但后者仍可有效降低TAO的活動性。 在中國上海地區(qū)的人群中未發(fā)現(xiàn)IFIH1基因A946T SNP等位基因頻率和基因型頻率在GD和正常人，TAO和正常人，以及有無眼病的GD患者中均沒有顯著差別。 結論： 1.Ad-TSHR-A免疫雌性BALB/c小鼠成功建立了GD小鼠模型，該模型中，肝損發(fā)生率較高，但眼病發(fā)生率很低。 2.Th1免疫反應在GD發(fā)生中起著重要

10、作用。通過移植GD小鼠的致敏淋巴細胞的方法不能建立TAO模型。PA多肽粘膜免疫不能有效抑制GD的發(fā)生。 3.靈芝多糖可能加重GD小鼠的甲亢狀態(tài)，但可以改善GD引起的肝臟損害。 4.患者的發(fā)病年齡和是否吸煙是影響GO嚴重程度的主要因素，而有無家族史則會影響到TAO的發(fā)病年齡。 5.激素是TAO有效的治療方法，靜脈甲強龍療效最好；球后放療療效較差，但仍可有效降低TAO的活動性。 6.在中國上海地區(qū)的人群中，I